重组体的筛选.pptx

将目的将目的DNA片段与载体连接形片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重成重组子，然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞，得到所需要的组子导入宿主细胞，得到所需要的带有重组带有重组DNA的转化子，这是基因的转化子，这是基因工程的目的所在。工程的目的所在。转化子：转化子：导入外源导入外源DNA后获得了新的遗传标志后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。的细菌细胞或其他受体细胞。重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同和蛋白质三个不同水平进行鉴定。水平进行鉴定。重组子的筛选直接筛选间接筛选DNA鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法（报告基因等）Northern blottingWestern blotting标记补救筛选质粒载体的互补筛选（蓝白色斑筛选法）噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定（原位杂交）DNA序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定一、遗传学检测法一、遗传学检测法1、根据载体表型特征的筛选、根据载体表型特征的筛选（1）抗药性标记插入失活筛选法）抗药性标记插入失活筛选法第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法克隆Kan抗性基因（2）-半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落筛选白色菌落2、根据插入基因遗传性状的筛选 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。合成某一aa的基因载体酶切连接重组缺少该缺少该aa合成合成酶基因的菌株酶基因的菌株转化只缺少该只缺少该aa的的基本培养基基本培养基筛选重组子重组子生长、获得二、核酸分子的物理检测法二、核酸分子的物理检测法原理：原理：碱基配对碱基配对杂交双方：杂交双方：待测的核酸序列待测的核酸序列 插入片段基因制备的插入片段基因制备的DNA或或RNA探针探针核酸杂交方法：核酸杂交方法：菌落印迹原位（菌落印迹原位（in situ）杂交）杂交 斑点（斑点（dot）印迹杂交）印迹杂交 Southern印迹杂交印迹杂交 都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）或突起的或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。物上，然后同液体中的探针进行杂交。1、菌落印迹原位杂交、菌落印迹原位杂交将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与细胞或组织中的细胞或组织中的核核酸进行杂交，称为原位杂交。酸进行杂交，称为原位杂交。特点特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态实验步骤实验步骤 Smad2 mRNA Smad2 mRNA在系膜增生型在系膜增生型IgAIgA肾病肾小球的表达肾病肾小球的表达 原位杂交原位杂交200200 肺腺癌肺腺癌-cat mRNA -cat mRNA 原位杂交法原位杂交法400400 2、斑点印迹杂交、斑点印迹杂交 斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同 将将将将RNARNA或或或或DNADNA变性后直接点样于变性后直接点样于变性后直接点样于变性后直接点样于NCNC膜或尼龙膜或尼龙膜或尼龙膜或尼龙膜上膜上膜上膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品优点：简单、快速、可同时检测多个样品 常用于病毒核酸的定量检测常用于病毒核酸的定量检测RNA或或DNA 变性变性 NC膜膜固定固定 杂交杂交 放射自显影放射自显影 检测检测实验原理与步骤实验原理与步骤提取提取碱溶液碱溶液点样点样加热加热放射性探针放射性探针一定条件一定条件X-X-底片底片显影、定影显影、定影标记斑点标记斑点3、Southern 印迹杂交印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA与与DNA的杂交的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳至膜至膜（尼龙膜或硝酸（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）纤维素滤膜）上上转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜实实验验步步骤骤白瓷盘白瓷盘玻玻璃璃板板滤滤纸纸凝胶凝胶尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物吸水纸转膜吸水纸转膜 用于分析混合DNA样品中是否存在能与特定探针杂交的序列。Southern杂交由于滤膜是从凝胶上原位印迹而来，因而能够显示出与探针杂交的DNA片段的大小。用用 途途Southern杂交定位杂交定位kan抗性基因抗性基因 4、直接凝胶电泳检测法、直接凝胶电泳检测法利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。分子量分子量 Marker载体载体重重组组克克隆隆实实验验步步骤骤 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 5、酶切电泳筛选法、酶切电泳筛选法原原 理理根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）带数和长度）用合适的内切酶切下插入片断，再用其用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果。它酶切这个片断，电泳后比较结果。ABA或或B不同克隆的酶切结果不同克隆的酶切结果筛选过程筛选过程第二节第二节 免疫化学与核酸分析法免疫化学与核酸分析法利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1.原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2.方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：原理一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 2.ELISA的局限性的局限性有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）四、四、Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白Western装置装置 Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物，并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Blotting过程过程结果结果多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结果结果检测与特定蛋白质结合的检测与特定蛋白质结合的DNADNA序列的序列的部位及特性部位及特性优点：优点：可形象地展示出特殊的蛋白可形象地展示出特殊的蛋白质因子同特定质因子同特定DNADNA片段之间的结合区片段之间的结合区域域五、五、五、五、DNaseDNase足迹实验（足迹实验（footprinting assay）3232p p1 5 1 5 1010*1 4 8 1 4 8 1010*加入蛋白质加入蛋白质X X加入加入DNaseIDNaseI凝胶电泳放凝胶电泳放射自显影射自显影1 15 51010A BA B足迹足迹足迹足迹(a)(a)(c)(c)(b)(b)DNaseI DNaseI DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验足迹实验足迹实验