肝癌细胞凋亡调控的研究进展.docx

【摘要】 肝癌（hepatocellular carcinoma, hcc）为我国常见恶性肿瘤之一。体内的动物实验以及未经 治疗 的hcc均存在细胞凋亡现象。 细胞凋亡是一个复杂的 网络 系统, 受多系统、多水平、多因素共同调控。诱导其细胞凋亡的各种 方法 在 理论 上来说就可以治疗肝癌。本文综合论述了有关参与肝癌细胞凋亡的一些因素如p53, bcl-2, survivin，caspase，trail， cox-2在调整细胞增殖与细胞凋亡平衡中的相互作用， 以及某些抗肿瘤治疗的可能机制。【关键词】 细胞凋亡; p53; survivin; caspase; trail; cox-2肝癌（hepatocellularcarcinoma, hcc）有原发性肝癌和继发性肝癌之分， 原发性肝癌为我国常见恶性肿瘤之一。体外培养的肝癌细胞, 体内的动物实验以及未经治疗的hcc均存在细胞凋亡现象, 凋亡指数的高低直接关系到肝癌患者的预后。细胞凋亡是机体清除衰老、异常细胞, 维持内环境稳定的重要生理功能。免疫应答、造血系统的调控、胚胎的发育、肿瘤的形成都与细胞凋亡息息相关。肿瘤的发生、 发展 与正常的细胞凋亡过程被抑制， 破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡有一定关系。 现在广泛认为细胞凋亡是一个复杂的网络系统, 受多系统、多水平、多因素、多基因共同调控。诱导其细胞凋亡的各种方法在理论上来说就可以治疗肝癌。本文简单介绍有关参与肝癌细胞凋亡的一些特异性（p53，fas，bcl-2/bax基因等）和非特异性信号分子以及其他因素在调整细胞增殖与细胞凋亡平衡中的相互作用， 以及某些抗肿瘤治疗的可能机制。1. 肝癌细胞凋亡通路的基因调控细胞凋亡是一个多基因调控的复杂过程， 主要是由诱导基因、 抑制基因和双向控制基因相互作用的结果。调控肝癌细胞凋亡的基因分为两大类, 一类是抑制肝癌细胞凋亡的基因, 主要有bcl-2和生存素（survivin）；另一类是促进肝癌细胞凋亡的诱导基因, 有p53、fas/fasl、trail等。通过这些基因的表达和相互作用, 对肝癌细胞凋亡的调控起着重要的作用。11 p53基因 p53基因是 目前 为止发现的最重要的抑癌基因, p53全长20kb, 位于人染色体17q13.1,由11个外显子构成, 是细胞生长周期中的负调控因子, 对细胞周期的调控、dna的修复、细胞分化、细胞凋亡等有重要生物学作用。几乎所有的肿瘤都存在p53的突变, p53的突变不只是引起野生型p53蛋白的失活, 还可能产生功能不同的突变p53蛋白。突变的p53具有促进细胞转化, 引起肿瘤细胞的大量增殖,抑制细胞的凋亡。据统计p53在hcc中的突变率在（69.3718.81）%, 分化越差, 突变率越高3, 由此产生的大量突变p53蛋白将 影响 下游基因的调控, 如bcl-2、bax等。12 fas基因 fas/fasl系统是机体重要的细胞凋亡系统,它包括fas、fasl 及它们的可溶性形式sfas、sfasl。fas蛋白为型跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子家族,分为胞外区、跨膜区和胞浆区。胞外区的n端有一个约含80个氨基酸的死亡域, 与凋亡信号传导有关。fas主要以膜受体形式存在, 可通过转录水平的不同剪接产生多种可溶性fas分子（sfas）, 它与fas较相似, 但缺少跨膜结构域, 与fasl结合后可对fas介导的细胞凋亡起重要的负调节作用。一般认为导致肝癌细胞凋亡是由于fas受体的激活和之后的caspase-8的激活， 或者通过fasl的上调9,10。部分抗肝癌药物（如干扰素）即是通过该途径11。fas在hcc中表达明显减少, 甚至完全丧失,而且fas的表达与hcc的分化程度有关,分化程度愈低, fas表达愈少。多数hcc 对fas/fasl介导的细胞凋亡耐受,可能是hcc 上的fas表达较少, 或者sfas竞争性地与fasl结合, 阻断了fas/fasl介导的细胞凋亡。有报道hcc表达高水平的fas和fasl在同一个区域, 且对fas/fasl介导的细胞凋亡耐受12, 认为可能是hcc上的fasl与抗肿瘤淋巴细胞fas结合, 引起淋巴细胞的死亡, 逃脱免疫监视；fas介导的细胞凋亡受多种蛋白及酶类影响, 如肿瘤细胞上的fas相关磷酸脂酶-1、flip（flice/caspase-8inhibitoryprotein）可与fas受体结合, 抑制fas介导的信号传导。bcl-2、p53以及一些癌基因对fas也具有重要的调节作用13。bcl-2在急性肝炎的胆管中存在，在肝癌中失表达。其高表达可导致肝癌细胞对多种促凋亡因素如药物、射线及cytokin等耐药，而诱导剂（天花粉、氧化砷）通过下调肿瘤细胞bcl-2的表达诱导肝癌细胞的凋亡。bax高表达能增强由adriamycin诱导的 hcc-9204细胞的凋亡，增强细胞对凋亡的敏感性18。14 survivin基因 survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, iap）的新成员，与其他iap成员不同，结构独特，只含有一个杆状病毒iap重复序列（baculovirus iap repeat）和非锌指结构，survivin位于人染色体17q25,含有4个外显子和3个内含子,相对分子质量为2510319。研究发现survivin 在肝癌中具有选择性表达的特性，这一特性为其在原发性肝癌中治疗靶点作用提供了理论依据。survivin与凋亡抑制呈正相关，与预后密切相关。 ikeguchi等20对57例hcc检测发现,41%的肝癌组织有survivin mrna的表达,其表达与年龄、性别、肿瘤大小无关,在正常肝组织中没有检测到,survivin表达阳性的肝癌组织的凋亡指数显著低于survivin表达阴性的肝癌组织。但是目前对survivin的功能尚存争议。一些研究显示, survivin对细胞凋亡以及增殖并无明显影响。另外一些研究则显示，survivin具有抑制凋亡和调节细胞分裂的双重功能,有助于多种肿瘤细胞低预各种凋亡刺激。survivin抑制凋亡的机制是通过bir功能区直接影响凋亡信号传导通路的终末效应分子caspase-3或caspase-7的活化,从而抑制多种上游信号所诱导的凋亡, 也发现survivin抑制细胞色素c从线粒体释放, 阻断上游信号分子caspase-9的活化,从而阻断细胞凋亡信号的传导 19,27。gaoyan等21设计一对survivin-sirna,体外转录制备sirna, 观察了 应用 rnai技术靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株hepg2增殖和凋亡的影响, 细胞凋亡检测发现细胞凋亡率并无变化。而王颖等22发现不同浓度 survivin sirna 转染能下调survivin 蛋白和 mrna 表达，诱导肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性,提示采用基因技术封闭 survivin 蛋白表达，可以解除 survivin 对凋亡的抑制作用，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗的目的。另外据 文献 报道, survivin反义核酸能够明显诱导肿瘤细胞凋亡和抑制增值，是肿瘤反义期治疗的较理想的靶基因。chen等23发现, 在smmc-7721 细胞中caspase-3的活性水平极低。这有利于肝癌细胞逃避凋亡,维持较高的增殖活性。而在survivin asodn 转染后, caspase-3 活性水平呈剂量依赖性升高, 说明在smmc-7721 细胞中caspase-3 的低活性状态可能是由于survivin 表达所致；以asodn 封闭survivin基因表达导致的caspase-3活化, 是其诱导肝癌细胞凋亡过程中的关键环节。cheng等24发现rnai能降低smmc-7721 细胞中survivin基因表达，从而诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的生长。尽管survivin对细胞凋亡以及增殖的影响目前还存在争议，已有结果显示survivin机制的研究有助于对肝癌细胞凋亡的认识，为抗癌治疗提供有效靶点有着重要的意义。2. 调控肝癌细胞凋亡的其他因素除基因外，很多酶、信号分子等参与凋亡的启动和调节，如caspase家族，tgf/tgf受体, tnf家族, cox-2等，调整着细胞增殖与凋亡的平衡。2.1. 半胱天冬酶（caspase）家族 细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族，凋亡可能就是蛋白酶级联切割的过程。其中研究最多，功能相对较明确的为caspase-3, 是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶之一，为凋亡的效应分子，被称为凋亡的“执行者”25。经典的细胞凋亡途径有两条，分别是细胞外途径（细胞表面死亡受体途径）和细胞内途径（线粒体引发途径）。在细胞外途径中，死亡信号的传导依赖于死亡配体与受体（如tnf-和tnfr, fasl和fas）的结合，接着死亡受体的死亡结构域（dd）与信号传导分子（如fadd）结合，而fadd又可与caspase-8酶原的ded相连接，形成死亡诱导信号复合物（disc），随之caspase-8被激活，它通过裂解bid使线粒体释放细胞色素c，或直接作用caspase-3及其他下游的caspase。有研究显示激活的caspase-3可裂解相应的胞核内底物dna修复酶（poly adp-ribose polymerase， parp），使parp失去对dna的修复功能，导致细胞转向凋亡 26。研究发现在fas介导肝癌细胞系凋亡过程中，caspase-3活性增高，使用caspase-3抑制剂devdcho能显著抑制caspase-3的活化，藉此抑制fas介导的细胞凋亡。而ice抑制剂yvadcho则不能抑制fas介导的细胞凋亡。提示在fas介导的人肝癌细胞系凋亡过程中，主要起作用的是caspase-3，而不是icea。于合成紫花茄皂贰诱导人肝癌细胞株bcl-7402凋亡的体外实验中发现，紫花茄皂贰通过上调细胞内细胞色素c的表达水平而激活caspase-3，从而导致细胞凋亡17。nk-104是日本新近研制的第三代hmg-coa还原酶抑制剂，研究结果表明10 mol/l nk-104能够增强caspase-3的活性，加入mev能够消除nk-104的这种诱导作用 27。caspase可被多种物质激活，一般认为化疗药物以及高渗引起细胞凋亡大多通过激活caspase-3起作用28。 低浓度的谷胱甘肽-阿霉素（gsh-dxr）比dxr更有效地引起鼠肝细胞（ah66）的凋亡，并能提高caspase-3大约100倍。两种药物处理12和15h后可见caspase-3的活性增加和dna的断裂29。可见凋亡前各种强信号激活caspase-3是凋亡突增的必经途径。在细胞内途径中，细胞内的死亡信号，如dna损伤、毒素、bax、癌基因抑制剂、紫外照射和atp耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素c（ cyt c）到胞质，随即 atp 依赖性激活凋亡蛋白水解酶活化因子-1（apoptotic protease-activating factor1，apaf-1）。 在这一途径中， cyt c 的释放是该调节通路中的关键事件，它可导致由 cyt c，apaf-1 和 procaspase-9 构成的“凋亡体”（apoptosome）形成，从而激活 caspase-9。 活化的caspase-9 从“凋亡体”中释放出来，进而引发 caspase级联放大反应，最终导致细胞凋亡。以往研究中已证实氟尿嘧啶可诱导肝癌细胞凋亡，并有外源性通路上的相关基因参与调控。最近研究显示在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase-9 被活化，活性明显增强，caspase-9 抑制剂可阻断这一过程。表明 caspase-9参与了氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡30。 cyt c 由核基因编码，在核糖体中合成前体物阿朴细胞色素 c（apocytochrome c）后转运入线粒体。 diekert 等31发现，在apocytochrome c 转运进入线粒体时需要 tom 复合体，并认为 tom 复合体是包括 apocytochrome c 在内的细胞凋亡相关蛋白进入线粒体的共同通路。在三氧化二砷（as2o3）诱导肝癌细胞凋亡的基因 分析 中显示线粒体外膜受体tom20基因表达上调。综上所述，caspase-3、 caspase-9 的活化被认为是细胞凋亡机制中的重要环节。目前的关键 问题 是caspase-3、 caspase-9等在多种因素诱导的肝癌细胞凋亡中是否起独立作用，其表达与肿瘤细胞的凋亡是否存在必然关系，另外，其激活机制及联系尚未清楚，有待于我们进一步的深入研究。2.2. 坏死因子相关凋亡诱导配体（tumornecrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand, trail）trail是肿瘤坏死因子（tumornecrosisfamily, tnf）家族成员, 可与tnf受体超家族成员类似的胞浆死亡结构域结合, 通过死亡结构域激发和传导死亡信号, 激活caspase蛋白酶级联反应, 导致细胞凋亡。trail的一个显著特点就是能在各种转化细胞中选择性导致凋亡，但在正常组织中却无此作用。在对肝癌的研究中发现, 尽管大部分的人类肿瘤对trail诱导的凋亡敏感, 但hcc对trail诱导的细胞凋亡明显耐受32。trail可以诱导nf-b表达的增高, 后者可抗细胞的凋亡。有学者用特异性的nf-b抑制剂sn50 作用于trail 诱导的hcc细胞凋亡, 发现该抑制剂对trail诱导的细胞凋亡没有多大影响, 表明trail诱导的nf-b活性升高与trail对hcc诱导的细胞凋亡耐受并不相关联。 认为hcc对trail诱导的细胞凋亡耐受可能是肿瘤细胞内存在凋亡抑制剂, 如cfilp（caspase8/fliceinhibitory protein, cfilp）、bcl-xl、bax、bid等33。 也有研究发现经trail处理后，肝癌细胞出现了凋亡的同时bcl-2, bcl-xl抗凋亡蛋白的表达均呈上升趋势，而促凋亡蛋白bax的表达却呈现出下降的趋势。深入研究发现经trail处理后细胞的nf-b活性明显升高，提示肝癌细胞经trail刺激后，细胞内的nf-b被激活，进而后者又导致了抗凋亡蛋白表达上调，促凋亡蛋白表达下降，使得细胞具有药物抵抗性。nf-b的蛋白酶抑制剂mg-132与trail联合应用后细胞凋亡程度明显高于单独使用trail组，而mg-132本身并无明显诱导凋亡的作用；同时，两者联合应用后，mg-132也显著抑制了trail刺激细胞nf-b活性增高的现象。进一步证明 nf-b参与了trail诱导细胞凋亡过程中所同时激发的细胞抵抗作用34。另外，trail在肝癌的基因治疗中可以起到旁观者效应,即可使转导目的基因的肿瘤细胞死亡,同时又可使临近没有转导目的基因的肿瘤细胞死亡,可在相同转导效率的情况下提高目的基因对肿瘤细胞的杀伤,在一定程度上解决目的基因转导效率低的问题。zhang等35发现人端粒酶逆转录酶htert干扰明显增加trail诱导的肝癌细胞凋亡,其机制可能与procaspase-8表达增加，端粒酶活性降低和端粒酶长度短有关，而与bcl-2和bax无关，但是htert干扰后通过何种途径增加trail抗癌活性仍然需要进一步的研究。内容总结（1）【摘要】 肝癌（hepatocellular carcinoma, hcc）为我国常见恶性肿瘤之一（2）现在广泛认为细胞凋亡是一个复杂的网络系统, 受多系统、多水平、多因素、多基因共同调控（3）研究发现survivin 在肝癌中具有选择性表达的特性，这一特性为其在原发性肝癌中治疗靶点作用提供了理论依据