医学检验实验指导.doc

《临床检验基础》
实验指导

（供医学检验专业五年制本科使用）

遵义医学院医学检验系组编
2005年12月

第一章 外周血常规检验综合评价实验

【检验流程】
熟悉检验方法及原理

试剂配制及准备

标本采集及处理

白细胞计数及分类计数
红细胞计数及血红蛋白测定
血小板计数

检验结果综合评价及临床意义探讨

实验一 红细胞计数
【目的】 掌握显微镜红细胞计数（red blood cell count）方法。
【原理】 用等渗稀释液将血液稀释一定的倍数，充入计数池后，在显微镜下
计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。
【器材】 显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒。
【试剂】 红细胞稀释液（Hayem液）：氯化钠1.0g，结晶硫酸钠5.0g（或无水硫酸钠2.5g）蒸馏水加至200ml。溶解后加20g/l伊红溶液1滴，过滤后使用。
【标本】 外周血或抗凝血（EDTA抗凝）。
【操作】
1． 稀释液 取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。
2．加血 用清洁干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，檫去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清夜清洗吸管2~3次，立即混匀。
3．充池 混匀或用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放3~5min，待细胞下沉后于显微镜下计数。
4．计数 用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个方格内的红细胞数。
5．计算
红细胞/L=N×25/5×10×106×200=N×1010=N/100×1012
N ： 表示5个方格内数得的红细胞数。
25/5 ：将5个大方格内数得的红细胞数换算成1个大方格的红细胞数。
×10 ：将1个大方格红细胞换算成1ul血液内红细胞。
×106：1L＝106ul
200：为血液的稀释倍数
【注意事项】　
1． 采血时不能过分挤压采血部位，针刺部位深度必须适当。
2． 采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。红细胞数量增高时可适当加大稀释倍数。
3． 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则。避免多数或漏数。
4． 稀释液要过滤，小试管、计数板均须清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为是细胞。
5． 如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。
6． 将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡、或充池不足的现象。
7． 红细胞在计数池中若分布不均，每个方格之间相差超过20个以上时要重新充池计数。正常数值范围内，2次红细胞计数相差不得超过5%。
【方法学评价】 目视计数法是传统的的红细胞计数法，不需要特殊设备，但操
作复杂、费时。
【质量控制】
1．计数评价　在细胞计数的评价中，多采用两差比值（r）评价。
2．稀释　造成稀释倍数不准确的常见原因有：①稀释液或血液加样不准确。②吸血时吸管内有气泡。③未檫去吸管外血。④血液加入稀释液时使上清液浑浊，血液被吸管带出。⑤稀释液放置的时间过长，蒸发浓缩。
【参考值】
①成年男性：（4.0～5.5）×1012／Ｌ。
②成年女性：（3.5～5.0）×1012／Ｌ。
③新生儿： （6.0～7.0）×1012／Ｌ。

实验二 血红蛋白测定
氰花高铁血红蛋白测定法
【目的】 掌握氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定方法。
【原理】 在血红蛋白转化液中，除硫化血红蛋白外，其余血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与氰离子（CN-）结合，生成稳定的复合物氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide，HiCN）。棕红色的氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰，可用校正的高精密分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN参考液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。
【器材】 一次性消毒采血针，微量吸管，试管。5ml移液管，75%（V/V）乙醇棉球，无菌干棉球，分光光度计，试管。
【试剂】
1．HiCN转化液（文齐液）氰化钾（KCN）50mg，高铁氰化钾[K3Fe（CN）6]200mg，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）140mg，Triton X –100 1.0ml，蒸馏水加至1000ml，纠正pH至7.0~7.4。此液淡黄色透明溶液，用蒸馏水调零，比色杯径1.000cm，波长540nm处的吸光度应<0.001。贮存在棕色有塞玻璃瓶中，放4℃冰箱保存，一般可保存数月。如发现试剂变绿、浑浊不能使用。
2．HiCN标准液（200g/L）商品试剂。
【标本】 外周血。
【操作】
1．直接定量测定
（1）加转化液：试管内加5mlHiCN转化液。
（2）采血与转化：取全血20ul，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。
（3）测定：以符合WHO标准的分光光度计（常规测定时带宽应小于6cm）。波长540nm处，光径（比色杯内径）1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度（A）。
（4）计算：根据标本的吸光度（A）直接计算出血红蛋白浓度（g/L）。
血红蛋白（g/L）=A×64458/44000×251+A×367.7
A： 540nm处测定管吸光度。
64458：目前国际公认的血红蛋白平均相对分子量。
44000：1965年国际血液学标准化委员会（ICSH）公认的血红蛋白摩尔消光系数。
251：稀释倍数。
2．HiCN标准液比色法测定
（1） 标准曲线绘制和K值计算。用HiCN标准液倍比稀释后（50g/L、100g/L、150g/L、200g/L），在所用的分光光度计上（相当540nm处）分别测定各稀释度的吸光度，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出此换算常数K。
（2） 标本的血红蛋白转化和比色同直接测定，得到标本的吸光度（A）。
（3） 通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度，即Hb（g/L）=K×A
例，如倍比稀释后HiCN标准液50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，分
别测得540nm处的吸光度为0.13、0.27、0.41、0.54，标本的吸光度为0.32。先求K值，再计算出标本的血红蛋白浓度（g/L）。
 K=ΣHb/ΣA=50+100+150+200/0.13+0.27+0.41+0.54=370.37
Hb=370.37×0.32=118.52（g/L）
【注意事项】
1． 血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法，都必须以HiCN法为标准，绘制标准曲线。标准曲线或K值应定期检查，并与分光光度计相配。
2． 标准微量吸管必须经过水银称重法校正。加液必须准确，血液与转化液充分混匀。可用血红蛋白代替抗凝血进行鉴定。
3． HiCN转化液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液应贮存在棕色他塞是玻璃瓶中，4℃冰箱保存一般可用数月，但不能在0℃以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使转化液褪色失效。HiCN转化液是一种低离子强度而pH又近中性的溶液，遇到白细胞过多或异常球蛋白增高的血液标本，HiCN比色液会出现浑浊。若因白细胞过多引起的浑浊，可离心后去上清液比色；若因球蛋白异常增高（如肝硬化者）引起的浑浊，可向比色液中加如少许固体氯化钠或碳酸钾，混匀后可使溶液澄清。
氰化钾是剧毒品，配置转化液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN转化液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在。毒性不是很大。若进入人体宁日，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CN-，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢算气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中。按没升HiCN废液加次氯酸钠溶液（安替福民）40ml，充分振摇混匀，敞开容器，置室温3h。
【方法学评价】 HiCN法操作简便，试剂单一，除SHb外所有血红蛋白均可迅速转化为HiCN，显色快且稳定（显色后若保存得当可达6年不褪色），可以根据吸光度直接计算结果，因此被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法，但其试剂中氰化钾为剧毒药品，须妥善保存，处理。另外，高铁蛋白血症和白细胞明显增高的标本可导致反应液浑浊而影响结果。
【质量控制】 若用分光光度计作精密定量测定，分光光度计的波长和吸光度
需要校正，带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm，允许误差为0.5%（即
0. 995~1.005），测定温度为20~25℃。仪器的校正是测定中的关键。校正大致分
为以下几个步骤。
1．波长 将100~150g/L的HiCN标准液放在待检分光光度计中，从500~600nm分几个波段测定H iCN标准液的吸光度，如所测最大吸收凤在540nm，表示分光光度计波长准确；实际工作中对波长偏差不大的分光光度计可把吸收峰波长（如在536nm）当作540nm进行测定。
2．HiCN吸收光谱峰值在540nm，峰谷在504nm。杂光的增加使HiCN在吸收峰处吸光度下降，而对峰谷处吸光度影响不大。设Q值为反映杂光水平的参数，Q=A540/A504，合格的分光光度计Q值应为1.59~1.63。杂光可使吸收光谱的Q值减低。
3．比色杯 用HiCN试剂作空白，波长710~800nm，比色杯光径1.000时，吸光度应小于0.002。
4． 敏度和线性 用HiCN标准液倍比稀释（应包括高，低病理浓度）后，在数用的分光光度计上相当540nm分别测定各稀释度的吸光度，以标准液血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制曲线。观察各点连线是否为直线，如有个别点不在直线上，作图时应使直线通过尽量多的点。也可用直线回归法计算回归曲线（y=bx+a）后作图。将直线以外的实测吸光度与直线上理论吸光度比较，如两者之差在5%以内则可认为仪器符合线性的要求。直线的最低点即为该仪器HiCN法的灵敏度；最低与最高点间的范围即为仪器HiCN法的测定线性范围。
此外，引起测定值增高的常见误差是稀释倍数不准确，因红细胞溶解不当
引起标本浊度增加，血浆中脂质或蛋白量增加。
【参考值】　
① 成年男性：120~160g/L；成年女性：110~150g/L。
② 70岁以上老年男性：94.2~122.2g/L；女性：86.5~111.8g/L。
③ 新生儿：170~200g/L。

实验三 白细胞计数
【目的】 掌握显微镜法白细胞计数的原理及方法。
【原理】 用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将
稀释的血液注入血细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算
即可求出每升血液中的白细胞数量。
【器材】 显微镜、改良Neubauer计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。
【试剂】 白细胞稀释液：2%冰乙酸溶液中加入10g/l结晶紫（或亚甲蓝）3滴。
【标本】 新鲜全血或末梢血。
【操作】
1． 加稀释液 哟拗不过吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。
2．吸取血液 用微量吸管吸取新鲜全血或末梢血20ul，查去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管2~3次。
3．混匀 将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。
4．充池 再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer计数池中，室温静置2~3min，待白细胞完全下沉。
5． 计数 在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。
6． 计算
白细胞= 4个大方格内白细胞数（N）×10×20×106/4=N/20×109/L
【注意事项】
1． 吸管、微量吸血管、血细胞计数板均为计量工具，使用前需经过严格的校正，否则将直接影响计数结果的准确。
2． 是用标本可为由静脉穿刺采取的新鲜全血，也可为静脉末梢血。采集末梢血时，应注意采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，以免标本失去代表性；同时也注意不能过度挤压，以免组织液混入引起血液凝固或造成计数结果不准确。
3． 在充池时，如充液不足、液体外溢、断续充液，或产生气泡、充液 后移动盖玻片等，均会使细胞分布不均匀，造成计数结果不准确。
4． 计数池内的细胞分布应均匀，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%。若相差太大应重新充池。
5． 计数大小方格内的压线细胞时，应遵循数上不数下，数左不数右的原则。
6． 白细胞数量过多时，可采用加大稀释倍数的方法。如20ul血加入到0.78ml稀释液中或10ul血加到0.38ml稀释液中。
7． 白细胞数量过少时，可采用扩大计数域的方法，计数8个或9个大方格；也可采用减少稀释倍数的方法。
8． 白细胞稀释液不能破坏有核红细胞，它可使白细胞计数结果偏高，此时应计算白细胞校正值（公式中的有核红细胞是指分类100个细胞时所遇见的有核红细胞）。
白细胞校正值/L=100/（100+有核红细胞）×校正前白细胞数
【方法学评价】 显微镜目视计数法是传统的白细胞计数法，简便易行，不需昂
贵的仪器，可用于校正血液分析仪。可根据公式计算固有误差总变异系数。

CV=√1002/nb+4.62/nc+4.72/np
式中，为所数白细胞总数；n为计数板使用的次数；np所用吸管使用的次
数；因此，用于标准血液分析仪时，应在严格规范的田间下进行。如操作人员的选择、同一标本使用多只吸管、多个计数板、计数细胞数量达到一定的程度、多次重复等。这样才能避免计数板的固有误差、计数板和吸管的系统误差和操作随机误差的影响，使计数结果接近真值。
在实际工作中，显微镜目视计数法由于微量吸管、血细胞计数板、细胞分布
状态、人为因素等影响因素，其精密度和重复性欠佳。因而目前在临床工作中，多应用血液分析仪进行白细胞计数。经校准后的血液分析仪由于其计数细胞多，易于标准化，逼供内在严格质量控制和规范的操作步骤等条件下进行，因此，计数的精确性及准确性均较高。血液分析仪检测速度快，适合大规模健康人群的普查，但需要特殊仪器，某些人为或病理情况（如外周血出现有核红细胞、巨大血小板和血小板凝集等）可干扰白细胞计数。
【质量控制】 显微镜目视白细胞计数法质量控制的关键在于掌握误差规律，
严格遵守操作规程，减少误差，以期获得准确的结果。根据白细胞计数结果与血
涂片上白细胞分布密度是否相符来粗略判断计数结果准确性的方法，是人们在实
际工作中总结出来纯经验控制方法。另外还有几种方法可以用来进行一般的质量
控制与考核：①常规考核标准（routine checking standard，RCS）：根据白细胞在
计数池内四个大方格里的分布情况而规定。②变异百分率评价法：以测定值和靶
值差值的和绝对值来表示。③两差比值评价法：两差比值是同一标本或同一患者
在短时间内2次计数细胞数之差与2次计数细胞之和的标准之比。④双份计数标
准差评价法：选10~20份标本，每份重复2次计数，用双份之差计算标准差（s），
然后求得变异系数（CV）及质量得分。
【参考值】
① 成人：（4~10）×109/L
② 初生儿：（15~20）×109/L
③ 6个月~2岁：（11~12）×109/L。

实验四 白细胞分类计数
目的】 掌握显微镜外周血白细胞分类计数的方法及白细胞的在正常形态，
【原理】 将血液制成分布均匀的血涂片，用瑞氏染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞进行分；类并计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。
【器材】 显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸、清洁液。
【试剂】 瑞氏染液、磷酸盐缓冲液（pH6.4~6.8）。
【标本】 制备良好的血涂片。
【操作】
1． 染色 将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。
2． 低倍镜观察 低倍镜下观察白细胞的分布和染色情况。
3． 油镜观察 选择涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定的方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类，并用白细胞分类记数器作好记录，共计数100个白细胞。
4． 计算 求出各类白细胞所占百分率。
【注意事项】
1．由于各种白细胞体积大小不等、体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部较多，而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交界处。
2．分类时要有秩序地、沿一定方向地连续进行。既不重复亦不遗漏，避免主观选择视野。
3．分类计数结果的记录也可采用手工画“正”或“++++”的方法。
4．白细胞总数在（3.0~15.0）×109/L之间者，分类计数100个白细胞。总数在15.0×109/L以上时，应计数200个白细胞，而总数低于3.0×109/L时。则应选用2张涂片计数50~100个白细胞。
5．白细胞所占百分率，乘以白细胞总数，即可求出每升血液中各类白细胞数量的绝对值。
6．分类中如见血涂片上有幼红细胞，应逐个计数但不计入100个白细胞内，以分类100个白细胞见到幼红细胞多少个来报告，并应注明其所属阶段。
7．分类中还应注意观察成熟红细胞和血小板的形态、染色及其分布情况，注意有无寄生虫（如虐原虫）及其他异常所见。
【方法学评价】 显微镜法白细胞分类是经典、传统的血细胞分类法，目前还无
任何仪器可以完全取代。它能够准确得根据细胞形态特征进行分类计数，并可及
时发现异常细胞。血液分析仪进行细胞分类主要是从细胞的体积大小、细胞核形、
细胞化学染色等方面进行检测，检测速度快，分析细胞多，适宜于大批量标本的
筛检。对其筛检出来的异常标本，要准确识别细胞类别及确认病理改变还必须以
显微镜检查为准。
【参考值】 见下表
表：正常成人外周血白细胞分类参考值
白细胞分类
百分率（％）
分数数
绝对值（×109）
中性杆状核粒细胞
1～5
0.01～0.05
0.04～0.50
中性分叶核粒细胞
50～70
0.5～0.7
2～7
嗜酸性粒细胞
0.5～5
0.005～0.05
0.02～0.50
嗜碱性粒细胞
0～1
0～0.01
0～1
淋巴细胞
20～40
0.20～0.40
0.8～4.0
单核细胞
3～8
0.03～0.08
0.12～0.80
实验五 血小板计数
【目的】 掌握血小板的显微镜目视技术方法。
【原理】 血液经稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后，充入血细胞计数板内，在显微镜下计数一定范围内的血小板数量，经过换算求出每升血液中血小板的数量。
【器材】 显微镜，血细胞计数板，采血针，血红蛋白吸管，试管
【试剂】 10g/L草酸铵稀释液（草酸铵10g，EDTA－Na20.12g溶于1000ml蒸馏水中，混匀）
【标本】 外周血
【操作】
1． 吸取稀释液 准确吸取10g/L草酸铵稀释液0.38ml置于清洁小试管中。
2． 采血 常规消毒无名指，穿刺后，让血液自然流出，准确采血20ul置于含有草酸铵的稀释液中，立即充分混匀。
3． 稀释静置 待完全溶血后再混匀1min，置室温10min。
4． 充液静置 取混匀的血小板悬液1滴充入血细胞计数板内，静置10～15min，使血小板充分下沉。空气干燥的季节应将血细胞计数板置湿盒内。
5． 计数 用高倍镜计数血细胞计数板中央大方格内的四角和中央共5个中方格内血小板数量。
6． 计算 每升血小板数＝5个中方格内血小板数×109/L。
【注意事项】
1．稀释液要清洁，无细菌、尘埃等污染。存放时间较长后应过滤后再使用。
2．毛细血管采血时，针刺应达3mm深，使血液流畅。拭去第一滴血后立即采血，以防止血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数时，应先采血做血小板计数。
3．血液加入血小板稀释液内要充分混匀，但不可过度振荡，以免导致血小板破坏和聚集。
4．血小板悬液充入血细胞计数板内需要静置10～15min，使血小板完全下沉后再计数。但应注意保持湿度，避免水分蒸发而影响计数结果。
5．计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃等的鉴别，附着在血细胞旁的血小板也要注意，不要漏计。
6．应在1小时内计数完毕，否则结果偏低。
7．所用计量器材必须标准化。
8．检查前，患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物。
【方法学评价】 目前血小板计数方法主要有两大类，血小板分析仪法和目视显
微镜计数法（普通光学显微镜和相差显微镜目视计数法）。显微镜血小板计数法
以草酸铵法为参考方法。草酸铵稀释液为首选的稀释液（其对红细胞破坏力强，
血小板清楚）。血液分析仪法由于重复性好目前逐渐普及。但由于血液分析仪不
能完全将血细胞与其他类似大小的物质区别开来，因此计数结果有时仍需目视显
微镜计数法作校正，因而国内外仍将目视显微镜计数法（特别是相差显微镜计数
法）作为参考方法。
【质量控制】
1． 定期检查稀释液的质量，检测前先作稀释液空白计数，计数值为零时方可充液计数。
2． 在充液之前必须轻轻摇动标本2min或200次以上，但用力不宜造成血小板破坏或产生气泡，引起计数误差。
3． 血小板如成族分布，应重新采血复查。溶血欠佳时，应更换稀释液或用200倍稀释法计数整个中间大方格内的全部血小板数，最后计算出每升血液中的血小板数量。
4． 如果血小板悬液冲入计数板后时间较长，血小板会失去光泽而不易辨认，因此应掌握好计数时间。
5． 每份标本最好计数2次，若计数之差在10％以内，取其均值报告。若计数之差大于10％，应作第3次计数，取2次相近结果的均值报告。
6． 草酸铵质量必须是AR级或GR级，若用CP级溶血效果差。
【参考值】
（100～300）×109/L
第二章 尿液常规检验综合评价实验

【检验流程】
熟悉检验方法及原理

试剂配制及准备

标本采集及处理

尿液有形成分检查
尿液化学检查
尿液理学检查

检验结果综和平价及临床意义探讨

实验一 尿葡萄糖定性检查
一．班氏法
【目的】 掌握尿葡萄糖定性的班氏（Benidict）法。
【原理】 葡萄糖或其他还原糖的醛基在热碱性溶液中，能将班氏试剂的兰色硫酸铜还原为黄色的氢氧化亚铜，进而形成红色氧化亚铜沉淀。
【器材】 试管架、中试管（12mm×100mm）、滴管、试管夹、酒精灯。
【试剂】
1．甲液 枸橼酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）8.5g，无水碳酸钠76.4g，蒸馏水700ml，加热助溶。
2．乙液 硫酸铜（CuSO4·5H2O）13.4g，蒸馏水100ml，加热助溶。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中，不段混匀，冷却至室温后补充蒸馏水1000ml/、。如溶液不透明则需要过滤，煮沸后出现沉淀或变色则不能应用。
【标本】 新鲜尿液。
【操作】
1．鉴定班氏试剂质量 取中号试管1支，加入班氏试剂2.0ml，摇动试管徐徐加热至沸腾，观察试剂有无颜色及性状变化，若试剂仍为透明蓝色，可进行以下实验。
2．尿液 向班氏试剂中加离心后的尿液0.2ml（约4滴），混匀。
3．加热煮沸 继续煮沸1~2min，或置沸水浴5min。自然冷却。
4．判断结果 判断结果见下表
表 班氏法糖定性实验结果判断
反应现象
报告方式
葡萄糖含量（mmol/L）
蓝色不变
—
〈 5.6
蓝色中略带绿色，但无沉淀
+-
5.6~11.2
蓝色，伴少许黄绿色沉淀
+
〈 28
较多黄绿色沉淀，以黄为主
++
28~56
土黄色浑浊，有大量沉淀
+++
57~112
大量棕红色或砖红色沉淀
++++
〉112

【注意事项】
1． 试剂与尿液的比例为10：1。
2． 煮沸时应不时摇动试管以防爆沸喷出，也可在沸水浴中实验。
3． 检验糖尿病患者尿液中的葡萄糖，应空腹或餐后2h留取尿标本。
4． 尿液中有大量尿酸盐存在，煮沸后呈浑浊并带绿色，但久置后并不变黄色而 呈灰蓝色，故必须于冷却后观察结果。尿中含大量氨盐时可抑制氧化亚铜沉淀的生成，应加碱煮沸除去。蛋白含量较高时也影响铜盐的沉淀，可用加热乙酸法除去。
5． 一些非糖还原性物质，如水合氯醛、氨基比林、PAS、阿司匹林、青霉素、链霉素、VitC、异烟肼等，当其在尿中含量过高时亦呈阳性反应，应停药3d后再行检查。对静脉输入大量VitC 者5d内不宜做尿糖定性，或定性时先将尿液煮沸使之分解破坏。
【方法学评价】 尿糖定性方法有班氏法和干化学试带法。班氏法稳定，灵敏度
为5.5mmol/L，但都缺乏特异性。尿中其他糖类（果糖、乳糖、戊糖等）和许多
还原性物质（肌酐、尿酸、Vit C等）都可起反应，因此容易出现假阳性。本法
逐渐被葡萄糖氧化酶试带法取代。
【质量控制】
1． 容器要清洁，不含氧化性物质，最好使用一次性尿杯。
2． 如气温较高，标本不宜长时间存放，以免细菌繁殖消耗尿中葡萄糖，造成假阴性。
3． 消除VitC的干扰，VitC对于实验有影响，因此注射大剂量VitC后5d内不做尿糖定性。如确实需要测定，则需注明用药剂量及时间，以便采取措施消除VitC的干扰，最简单的处理方法是先将尿液煮沸几分钟后再进行测定。
4． 在规定时间内判断结果，班氏法需待反应物自然冷却后观察。
【参考值】 阴性。
二．干化学试带法
【目的】 掌握尿葡萄糖定性的干化学试带法。
【原理】 尿液中葡萄糖使尿液单联或多联试带上的特殊试带模块颜色发生变化，呈色深浅与中葡萄糖浓度成正比。
【器材】 尿糖测定单联或多联干化学试带（附标准色板），尿液8项（或11项）分析仪，以及与之配套的干化学试带等。
【标本】 新鲜尿液。
【操作】 取试带1条，浸入尿液5s后取出。1min内在自然光或日光灯光线下与标准色板比色，或以尿液分析仪比色并打印结果。以邻联甲苯氨试带法为例。目测结果判断标准见下表。
表 试带法葡萄糖定性实验结果判断
反应现象
报告方式
约含葡萄糖量（mmol/L）
不变色
—
〈 2.2
浅灰色
+
5.5
灰色
++
14.0
灰蓝色
+++
28.0
紫蓝色
++++
112.0

【注意事项】
1．试带应避光干燥保存。
2．灵敏度受尿比密及温度的影响，浓缩尿灵敏度低，温度高时灵敏度高。
3．本法也受VitC等还原物质的影响，处理方法同班氏法。
【方法学评价】 干化学试带法较班氏法更为灵敏（2.2mmol/L）、简便、快速，
特异性高，具有半定量作用。可以目测，也可用于尿自动分析仪，但尿中含有
VitC等还原物质时，将与葡萄糖竞争过氧化酶而使结果呈假阴性。另外，高浓
度酮体、高比密尿均可减低试带的灵敏度，但该法极少出现假阳性。
除上述2种尿糖定性方法外，薄层层析法是鉴别、验证尿糖种类的特异性方，
但操作繁琐，不适合临床常规标本的测定。
【质量控制】
1． 容器要清洁，不含氧化性物质，最好用一次性尿杯。
2． 如气温教高，标本不宜长时间存放，以免细菌繁殖消耗尿中的葡萄糖，造成假阴性结果。
3． VitC对测定有影响，注射大剂量VitC后5d内不做尿糖定性。如确实需要测定则应先将尿液煮沸几分钟后再进行测定。
4． 注意高比密尿或高酮体尿对试带法的影响。必要时可用班氏法辅助确定阳性程度。
5． 尿糖定性实验只是作为糖尿病的筛查实验，如需要确诊或进行动态观察，必须结合血糖定量检查。
6． 阳性质控的使用，低浓度质控液（葡萄糖3g/L）定性为（+），高浓度质控液（15g/L）定性为（+++）。
【参考值】 阴性

实验二 尿酮体定性实验
一、改良Rothera法
【目的】 掌握改良Rothera尿酮体定性的方法及注意事项。
【原理】 亚硝酸铁氢化钠[Na2Fe（CN）5·2H2O]遇尿分解为Na4Fe（CN）6、NaNO2、Fe（OH）3和Fe（CN）5 3-。如尿中存在可检出量的酮体（NH2OON=）后者与Fe（CN）5 3-生成紫红色化合物。
【器材】 试管或载玻片、药匙、滴管。
【试剂】 亚硝基氢化钠0.5g（AR），无水碳酸钠10g（AR），硫酸铵10g（AR），试剂必须纯而无水，配置前分别将各试剂烘干、称量并研磨混匀。密闭存于棕色磨口瓶内，防止受潮。
【标本】 新鲜尿液。
【操作】
1． 加入酮体粉 于载玻片上（或试管内），加入1小勺酮体粉。
2． 加尿液 滴加尿液于酮体粉上，至完全将酮体粉浸湿。
3． 观察结果 观察酮体粉的颜色变化。5min内出现紫色者为阳性。
4． 判断结果 判断结果的标准见下表
【注意事项】
1． 尿内有大量非晶形尿酸盐时，可出现橙色反应，应离心除去。
2． 试剂应保存在干燥器内，以免受潮失效。
3． 该法必须在碱性并产热条件下进行，因此冬季最好放在30℃水浴箱中进行。
【质量控制】 尿液要新鲜测定，因乙酰乙酸不稳定、丙酮易挥发，陈旧性尿液会出现假阴性。
【参考值】 阴性。

二．干化学试带法
【目的】 掌握尿酮体定性测定的干化学试带法。
【原理】 以亚硝基铁氰化钠作酮体的显示剂，形成紫栗色化合物。
【试剂】 多联干化学试带及标准色板。
【标本】 新鲜尿液。
【操作】
1． 取尿液 将试带浸入被检尿液中，浸透后立即取出，及时那多余尿液在容器边缘吸去，1~2min（详见说明书）之内在日光灯下与标准色板比较或以自动分析仪测定。
2． 判断结果 不变色为（-），棕色为（+），棕红色为（++），紫栗色为（+++）。
【注意事项】
1．试带应放阴凉、干燥处，受潮后变软发黄即失效。
2．尿中含肌酐、肌酸较多时，可呈假阳性。
【方法学评价】 目前使用的成品试带有两类，一类只于乙酰乙酸反应，与其他酮体成分都不发生反应；另一类与乙酰乙酸和丙酮都起反应，但对乙酰乙酸的灵敏度明显高于丙酮，前者为50~100mg/L，而后者仅为400~700mg/L。两类试带与β-羟丁酸都不反应。由于试带法敏感、方便、快速，已取代了上述两种方法。
此外，还有其他用于酮体单项成分定性的湿化学方法，如Gerhardt乙酰乙酸
定性试验、β-羟丁酸定性实验等。其中β-羟丁酸定性试验对酮血症的早期诊断意义较大，此时乙酰乙酸尚未大量排出。但这些试验操作均较繁琐，影响因素多，而且灵敏度低，除特殊时需要外一般不用于常规检查。
【质量控制】
1． 尿液要新鲜，因乙酰乙酸不稳定，丙酮易挥发。陈旧性尿液会出现假阴性。
2． 由于各种方法对乙酰乙酸和丙酮的灵敏度不同，在不同的病程中所出现的酮体种类也存在差异，因此个结果之间缺乏可比性。在选折实验方法及分析结果时应加以注意。
3． 由于上述所以方法均不能检测β-羟丁酸，因此怀疑早期酮血症时最好测定血中D-3羟丁酸。
4． 阳性质控液的使用。低浓度质控液（无丙酮）定性阴性，高浓度质控液（丙酮1.6g/L）定性阳性。
【参考值】 阴性。

实验三 尿胆红素定性检查
一．Harrison法
【目的】 掌握尿胆红素定性测定的Harrison法。
【原理】 用硫酸钡吸附尿液中的胆红素并浓缩，胆红素与三价铁（Fe3+）反应，被氧化为胆青素、胆绿素和胆黄素的复合物，可显蓝绿色、绿色或黄绿色。
【器材】 离心机、试管或离心管、5ml刻度吸管。
【试剂】
1．0.14mol/L氯化钡溶液 氯化钡（BaCL2·2H2O）10.0g，溶于100ml蒸馏水中。
2．Fouchet集市 100g/L的FeCL3+溶液10ml，250g/L三氯乙酸溶液90ml，混合后备用。
3． 钡试纸 将优质滤纸裁策划能够0mm×80mm大小纸条，浸入饱和氯化钡溶液内（氯化钡30g，溶于100ml蒸馏水）数分钟后，室温或37℃温箱内待干，贮于有塞瓶中密封备用。
【标本】 新鲜尿液。
【操作】
（一） 试管法
1．浓缩胆红素 于10ml容量离心管中加入尿液5ml，再加入0.14mol/L氯化钡溶液2.5ml，混匀后离心沉淀3~5min，弃去上清液。
2．加试剂 向沉淀表面加Fouchet试剂2滴，放置片刻观察沉淀表面颜色的变化。
3．判断结果 结果判断见下表
表 Harrison法尿胆红素检查结果判断
反应现象
结果判断
报告方式
沉淀即刻变为蓝绿色
强阳性
+++
沉淀变为绿色
阳性
++
沉淀逐渐变为淡绿色
弱阳性
+
长时间不变色
阴性
—

【注意事项】
1．胆红素遇光易被氧化，因此标本要新鲜并避光保存。
2．Harrison法需要尿中有作够的硫酸根离子，如标本与氯化钡混合后不产生沉淀，可滴加硫酸氨试剂1~2滴，以促使沉淀形成。
4． 意药物的干扰，患者尿中含大量牛黄、熊胆粉、水杨酸和阿司匹林时易产生紫红色反应，可干扰Harrison法的结果观察。
5． 加入Fouchet试剂要适量（5ml尿加2滴），过多会使胆红素完全氧化成胆黄素而不显绿色，造成判断错误。
6． 如尿液呈碱性，可减低反应灵敏度，应加乙酸调至酸性。
【方法学评价】 Harrison法于反应前加入吸附剂，提高了灵敏度（0.5mg/L）。尽管操作较为复杂（若快速检验，也可采用纸条法），但准确性高，为化学试带筛检后的确证试验，此法已取代了Smith碘环法。
（二）氯化钡试纸法
1．将氯化钡试纸条一端浸入尿液中，至少深入50mm，5~10s后取出，平铺与细水纸上。
2．在滤纸上浸有尿掖的部位滴加Fouchet试剂2~3滴，观察颜色变化，结果判断同试管法。
【注意事项】 同试管法。
【方法学评价】 该法操作简便，适用于快速检验，与试管法具有相同的灵敏度。
【参考值】 阴性。

二．干化学试带法
【目的】 掌握尿胆红素定性检查的干化学试带法。
【原理】 根据偶氮耦联反应原理，在强酸介质中胆红素与重氮盐发生耦联反应，生成红色偶氮化合物。
【试剂】 单联或多联干化学反应试带（附标准色板）。
【标本】 新鲜尿液。
【操作】 将试带浸入待测尿中约2s，吸取多余尿液，与标准色板比色，1min内报告结果。按所用试带说明书进行结果判断，见下表
表 试带法胆红素定性检查结果判断
颜色变化
结果判断
报告方式
半定量（mg/L）
不变色
阴性
—
≤ 1.0
浅棕色
可疑
+-
1.5
黄棕色
弱阳性
+
2.0
红棕色
阳性
++
4.0
深棕色
强阳性
+++
≥ 8.0

【注意事项】
1．VitC和亚硝酸盐能抑制偶氮反应而呈假阴性，而大剂量氯丙嗪和高浓度的盐酸苯氮吡啶的代谢产物在酸性条件下则呈假阳性。
2． 试带法结果可疑者，最好用Harrison方式加以验证。
【方法学评价】 该类试带根据偶氮耦联反应原理而设计，各型号试剂带所用偶氮盐复合物大同小异。因反应改在干化学试带表面进行，大大提高了检测的灵敏度（二氯重氮氟化硼酸盐试带为2~5mg/L），有时还起到半定量的作用。加之操作简便、快速、可用仪器检测等优点，已