分子印迹技术.doc

分子印迹技术研究进展
摘　要　分子印迹技术是结合高分子化学、生物化学等学科发展起来的一门边缘学科。它对于研究酶的结构、认识受体-抗体作用机理及在分析化学等方面有重要的意义。本文从分子印迹聚合物的识别机理、分子印迹聚合制备条件和制备技术三个方面综述了分子印迹的研究进展,最后展望了分子印迹发展前景。
关键词：分子印迹聚合物;印迹分子;综述
40年代,Pauling。试图用锁匙理论解释免疫体系。虽然他的理论经后人的实践证明是错误的,但是在他的这种错误的理论中仍有两点是正确的:(1)生物体所释放的物质与外来物质有相应的结合位点;(2)生物体所释放的物质与外来物质在空间上相互匹配。正是基于这两点假设,化学家们发展了一项有效的分析技术称为分子印迹技术(molecularimprinting, MIP),在国内也有人把它称为“分子烙印”。1949年,Dickey首先提出了“分子印迹”这一概念,但在很长一段时间内没有引起人们的重视。直到1972年由Wulff研究小组首次报道了人工合成的有机分子印迹聚合物之后,这项技术才逐渐人们所认识,并于近10年内得到了飞速的发展。
MIPs具有三个特性: (ⅰ)预定性,可根据不同目的制备相应的MIPs; (ⅱ)识别性,MIPs是依据模板定做的,它具有与模板分子的立体结构和官能团相符的孔穴,所以选择性地识别模板分子;(ⅲ)实用性,它可以与天然的生物识别系统如酶与底物、抗原与抗体等相媲美,具有抗恶劣环境、稳定性高和使用寿命长等优点。二十多年来,在固相萃取、膜分离技术、异构体的分离等方面获得广泛研究,展现了良好应用前景。本文综述了MIPs的识别机理、制备技术条件及应用方面新进展.
1.分子印迹技术的基本概念和原理
分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。它是通过以下方法实现的:(1)首先以具有适当功能基的功能单体与模板分子结合形成单体-模板分子复合物;(2)选择适当的交联剂将功能单体互相交联起来形成共聚合物,从而使功能单体上的功能基在空间排列和空间定向上固定下来;(3)通过一定的方法把模板分子脱去。这样就在高分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配,并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空穴。这个三维空穴可以选择性地重新与模板分子结合,即对模板分子具有专一性识别作用。
这个三维空穴的空间结构和功能单体的种类是由模板分子的结构和性质所决定的。由于用不同的模板分子制备的分子印迹聚合物具有不同的结构和性质,所以一种印迹聚合物只能与一种分子结合,也就是说印迹聚合物对该分子具有选择性结合作用。
一个理想的分子印迹聚合物应具备以下性质:
(1)具有适当的刚性,聚合物在脱去模板分子后仍能保持空穴原来的形状和大小。
(2)具有一定的柔性,使底物与空穴的结合能快速达到平衡柔性对于分子印迹聚合物模拟酶来说尤其具有重要意义。
(3)具有一定的机械稳定性,这一点对于高效液相色谱(HPLC)尤为重要。
(4)具有热稳定性,使其能在较高温度环境下使用,因为对于一般的反应来说,温度较高使动力学上更有利。
2MIPs的识别机理
MIPs含有识别印迹分子的识别位点和孔穴,主要是通过共价键/非共价键作用进行分子识别。
2. 1　共价键结合作用
在MIPs的制备过程中,印迹分子与功能单位在聚合前先形成共价型化合物,聚合后再打开共价键,洗出印迹分子,得到MIPs。MIPs中识别位点的形状、功能基的精确排列与印迹分子互补。迄今为止,人们使用的共价键包括硼酸酯、西佛碱、缩醛酮等化学键。一般来说,共价键作用较强,在分子识别过程中结合和解离速度慢,难以达到热力学平衡,不适于快速识别,且识别能力与生物识别相差太远,制备条件苛刻且价格昂贵,近年来这种制备方法发展缓慢。
2. 2　非共价键结合作用
在制备MIPs的过程中,印迹分子与功能单体,首先通过一或几种非共键作用自组装成具有多点相互作用和确定关系的复合物,再加入交联剂和引发剂,聚合后这种相互作用被固定下来。
因为非共价键相互作用较弱,在温和条件下可以除去印迹分子,底物的结合和解离平衡也可以较快达到。聚合可除去绝大部分未反应的化合物,MIPs对印迹分子就具有较高的结合选择性。但这种印迹过程印迹分子与功能单位的化学计量数比不怎么明确,并难以确定。常见的非共价键作用有:氢键、静电力、金属螯合和疏水作用等。使用较多的是氢键,如果只有单一氢键作用,其识别效果不佳,但是在印迹过程中协同氢键或氢键和其他的非共价键共同作用时,MIPs就会具有很好的识别性。
2. 3　共价键和非共价键共同作用
聚合时功能单体和印迹分子通过共价键相作用,这样就可以获得在空间精确固定排列的结合基团。而在识别过程中,依靠的是非共价键作用,功能单体和印迹分子的结合/离解速度较快,操作简单,适于快速识别,并且其识别机理和生物
比较接近.
2.4分子印迹技术的分类
按照单体与模板分子结合方式的不同,分子印迹技术又可分为分子自组装(self-assembling)和分子预组织(preorganization)。两者的主要区别在于单体与模板分子结合的机理不同:分子自组装是指单体和模板分子之间是通过弱的相互作用力(如静电力、疏水作用力、氢键及金属配位健等)形成单体-模板分子复合物,而且是在溶液中自发形成的。
3　MIPs的制备条件
3. 1　反应条件的选择
3.1.1　功能单体　选择主要由印迹分子决定,首先功能单体能与印迹分子相互作用,且能与交联剂反应使印迹分子恰好镶嵌其中并获得预期的取向和定位。共价键MIPs具有苛刻的合成和断裂条件,相应功能单体有限,常用的功能单体为4-乙烯苯硼酸,二醇以及硼酸酯的硅烷混合物.
3. 1. 2　交联剂　交联剂是使印迹分子和功能单体形成高度交联、刚性的MIPs,“固化”功能单体的功能基于印迹分子的周围,除去印迹分子后形成与印迹分子在形状和功能基团上完全补的孔穴。MIPs要求很高的交联度(70-90% )。乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)是分子印迹中常用的交联剂。
3. 1. 3　反应试剂用量　印迹分子与功能单体的比值对分子印迹过程中识别孔穴的产生具有很大影响,对其比例的适当选择应该依据印迹分子所含有的官能团和制备过程中所用溶剂的性质,一般而言增大功能单体的比例可以充分地预组装印迹分子,但功能单体所占的比例并非越大越好,因为: (ⅰ)功能单体过量太多可增加由未参与组装的功能单体所产生的非选择性结合位点; (ⅱ)过大浓度的功能单体有可能引起自身的聚合而减少选择性结合位点数,所以印迹分子和功能单体的比例一般是1: 4。
3. 1. 4　溶剂　溶剂既是溶解用于聚合的所有试剂,也是制备MIPs的致孔剂,还影响功能单体和印迹分子间的结合强度、动力学性质和聚合物的形态结构,特别是在非共价键的结合体系中显得尤为重要。溶剂的用量对MIPs中孔穴的立体结构也有影响,用量太多会使MIPs的结构疏松、硬度变低而影响识别效果;用量太少又会减少MIPs中立体孔穴的数量。溶剂的极性等也不同程度地影响着印迹效果。极性大的溶剂可与印迹分子竞争功能单体,从而使制得的MIPs识别效果较差。
3. 1. 5　引发方式　制备MIPs的引发方式: (ⅰ)自由基聚合; (ⅱ)辐射聚合; (ⅲ)电化学聚合。自由基聚合是MIPs制备的常用引发方式,包括热引发聚合和光引发聚合。
3. 2　MIPs的制备技术
3.2. 1　本体聚合　早期大都采用本体聚合制备MIPs,即把印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶于惰性溶剂,密封在一个真空的安培管中,经聚合制得棒状聚合物,经粉碎、过筛、洗脱等得到所需粒状MIPs。但太过冗长。
3. 2. 2　原位聚合　是在色谱柱或毛细管等反应器内直接聚合制得连续型棒状MIPs。这种制备方法比较简便,没有繁琐的处理手续,且制得MIPs具有连续性、均一性的特点,从而得到较好的分离效果。此法制得色谱柱的方法简便,但柱压降偏高也限制了这种方法的广泛使用。
3.2. 3　悬浮聚合　是制备微球型MIPs常用方法之一:Mayes等率先用全氟烃为分散介质,加入特制的聚合物表面活性剂使印迹混合液形成乳状溶液,引发聚合后可得粒度分布窄、形态规则的MIPs微球,作为HPLC填料有低柱压和快速扩散的优点,但分散剂全氟烃不利于环保、价格偏高和表面活性剂的用量要求严格,制约了其实用。悬浮聚合工艺简单、制备周期较短,并且可在水中进行聚合而能够满足水溶性分子的印迹要求,但是所制MIPs粒径较大,影响其性能与实际应用。
3. 2. 4　溶胀聚合　溶胀聚合又称为多步溶胀悬浮聚合或种子溶胀悬浮聚合: (ⅰ)采用有/无皂乳液聚合法合成粒径较小的微球作为种子; (ⅱ)用一定的乳液进行多次溶胀种子,再通过还原剂的加入经光引发或热引发聚合物制得符合要求的MIPs微球。聚合反应可在极性溶剂中进行,所以制得MIPs可用于极性环境,这满足了酶模拟等生物环境的要求,同时MIPs的规整性和单分散性也好。另外,识别位点在MIPs微球的表面使得印迹分子的结合和洗脱可较快地达到平衡。
3. 2. 5　表面聚合　是把印迹分子和功能单体在溶剂中形成的复合物与表面活化过的硅胶/聚三羟甲基丙烷三丙烯酸酯粒子/玻璃等介质反应接枝聚合,从而制得MIPs的一种方法。这一方法解决了本体聚合中印迹分子包埋过深或过紧而难洗脱的问题。
3. 2. 6　MIPs膜的制备　MIPs膜具有分离和选择渗透的功效,且稳定性和机械强度明显优于生物膜还具有处理量大和反复使用等优点。MIPs膜的制备分为两种: (ⅰ)无支撑膜; (ⅱ)有支撑膜。Mathew-Krto以9-乙基腺嘌呤为印迹分子,把聚合溶液涂在硅烷化玻璃片上,制备出无支撑的MIPs膜,渗透实验表明腺嘌呤的流通量明显比胞嘧啶和胸腺嘧啶的大、腺苷的流量也大于鸟苷,这是腺嘌呤及其衍生物和膜中结合位点可逆结合和交换的结果。