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分子标记技术及其在小麦育种中的应用

摘要: 本文简要介绍了小麦中常用的分子标记技术的优缺点,如RFLP、RAPD、AFLP、SSR,并综述了分子标记技术在小麦遗传育种及遗传研究中的应用,包括抗病性育种、抗非生物胁迫育种、小麦品质育种、遗传图谱构建、种质资源鉴定等。
关键词:分子标记 遗传育种 小麦

Molecular marker technology and its application in Wheat Breeding
ZHANG Kai-hui，SHANG Jing
(Baoji College of Engineering Technolog ,Baoji 721013,China)
Abstract: This paper briefly introduces the advantages and disadvantages of molecular marker techniques, such as RFLP, RAPD, AFLP, SSR. They have been widely used in wheat and the following aspects of their application in wheat genetic breeding and genetic studies are summarized: disease resistance breeding, abiotic stress resistance breeding, wheat quality breeding, genetic mapping, identification of germplasm resources and so on.
Key words:Molecular marker； genetic breeding； Wheat

小麦作为人类主要粮食作物,其产量的提高具有极其重要的意义。目前,影响其产量的主要因素有病害、非生物抗逆性（干旱、盐碱地、高温等）,这些因素严重影响了小麦的品质和产量,因此,国内外的育种学家都在努力寻找相关基因并希望尽量地将它们聚集到某一品种中,以提高小麦的抗性使其品质得以改善产量有所提高。实践已经证明分子标记辅助育种技术在培育高产、高抗性、高品质、适应性广的小麦新品种中展示出了越来越重要的作用,发达国家应用也越来越广泛[1]。究其原因是分子标记辅助育种技术在育种中目标明确、选择快速高效,并且已经协助育种科学家和工作者选育出一些新的小麦品种。随着此技术与传统育种方法的进一步结合,必将发挥出更加重要的作用,但是, 由于小麦基因组太过庞大,使得该技术在小麦中的应用远远落后于其他作物（大麦、水稻、玉米等）。目前小麦中所获得的标记数量少,遗传图距大,饱和度低,可用的优异农艺性状相关的基因标记和抗性基因标记就更少,随着小麦育种学家和工作者的不懈努力,将来我们会获得更多地分子标记,为小麦新品种的选育提供更详细地遗传基础。
1.小麦中广泛应用的分子标记的优缺点
目前已经开发出了很多的分子标记,而广泛应用于作物育种的也就10多种,一般分为四类：第一类为基于Southern杂交的分子标记,如RFLP；第二类是依据PCR技术为核心的标记,如RAPD、SSR等；第三类是PCR技术与RFLP技术相结合产生的分子标记,如AFLP；第四类是新型分子标记技术,如SNP、EST标记 [2]。
1.1小麦中常用的分子标记及其优点
目前在小麦育种和科研研究中广泛应用的分子标记主要有RFLP、SSR、RAPD和AFLP等标记。各种标记的原理和步骤有许多文献报道,在这里主要论述它们的优缺点。遗传标记的发展共经历了四个阶段,即形态标记、细胞标记、同工酶标记和分子标记。在这四种标记中,只有分子标记是直接从基因水平进行检测的一种标记,而其它标记都是检测基因的表达产物。这就使得分子标记具有了其它标记不可比拟的优点：首要的优点是分子标记不会受到生理发育阶段、组织器官的限制,也不会受环境因素的影响,跟基因表达与否也没有关系,而其它标记无法避免这些因素的影响[3],因此其它标记必将被取代；其次前三种标记获得的标记数目少、历时长,而分子标记能在短时间内获得较多可用的标记,一般种类多、多态性高、遍布整个基因组；分子标记的另一个优点是表现中性,与目标性状和不良性状没有必然的联系,同时分子标记多为共显性标记,能区分杂合体和纯合体；最后选用分子标记不受选材限制,可用种子、幼苗、叶子等组织进行检测,不需要准备特殊的材料,也不会受小麦生长期的限制,从而可节省大量时间,操作技术也相对简便。
正是由于以上的优点,前三种标记随着分子生物学理论和技术的发展,不能适应时代的要求而逐渐被淘汰,而分子标记辅助育种技术在各种作物的抗性检测、品种鉴定、种质资源分析、绘制遗传图谱和基因克隆、性状基因检测与定位等方面发挥了越来越重要的作用。分子标记也不例外,存在优点的同时也存在一些不足,到目前为止也没有发现任何一种分子标记技术能完全满足育种的需求。
1.2分子标记的缺点
分子标记的缺点为一般需要一些特殊的仪器,用到的试剂很多都非常昂贵,有的标记技术程序复杂,结果不是很稳定,甚至对环境有污染,对工作者身体有伤害,所以目前仍处于科研单位或实验室应用,没有得到普及。
1.3小麦中常见分子标记优缺点的比较
RFLP标记来源于自然变异,表现为共显性,能鉴别纯合子和杂合子,技术成熟,能获得可靠的结果,目前应用很广泛,其缺点是DNA需求量大,而且对DNA质量要求也高, 需要用放射性元素,实验操作步骤烦琐,成本较高,对环境和人体有伤害作用。
RAPD技术克服了上述困难同时也产生了新的困难。该技术DNA模板用量少,操作简单、多态性高、易于检测、效率高、也不用放射性元素等优点,但也存在一些缺点,如显性遗传、不能识别杂合体和纯合体,稳定性不高、重复性差,一般都采用同一台仪器、同一厂家的同一批试剂来克服其重复性差的缺点。
1993年荷兰科学家利用RAPD和RFLP相结合开发出来AFLP标记,该标记结果稳定,检测灵敏,多态性丰富,重复性高,但其是一项专利技术,费用昂贵,并对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高,如果不能进行彻底酶切,其结果就不准确。
SSR标记是一种必较理想的标记,表现为共显性遗传,能检测纯合子和杂合子,重复性好,结果稳定,操作简便,在整个基因组中均匀分布,多态性高,另外DNA模板用量少,质量要求不高。但也存在一些不足之处,SSR标记需大量的克隆测序和引物设计,这就造成成本高,合成的引物还具有物种特异性,不能在种间转移。
2.分子标记辅助育种技术在小麦育种中的应用
分子标记在小麦中广泛应用于辅助育种、性状基因的标记与定位、遗传图谱的构建、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和分类等方面,该技术能快速准确地选择出理想的基因型个体,加快育种进程,使更多地优良性状和抗性基因聚集,培育出新品种。
2.1在小麦遗传育种中的应用
2.1.1在抗病性方面的应用
目前影响小麦产量和品质的主要病虫害有白粉病、条锈病和叶锈病,因此加强小麦病害防治的研究可以提升小麦的产量和品质。在小麦育种中,使常规育种策略与分子标记技术相结合, 利用分子标记可以从DNA水平直接检测抗病基因的存在与否,获得较好的育种植株,通过杂交或转基因手段使得抗病害基因迅速聚集,从而育种工作目标更加明确,迅速地鉴定阳性材料,大大缩短育种进程。目前已有报道RFLP、RAPD、AFLP、SSR 以及STS等标记应用于小麦抗病性研究。如王心宇等利用RAPD标记和SCAR标记对小麦抗白粉病基因Pm21的稳定性和应用进行了研究,利用RFLP标记和SCAR标记结合抗性鉴定有效地筛选到了多株聚合抗病基因植株,为培育小麦抗性品种提供了理论基础[2]。王长有利用分子标记技术对小麦抗白粉病种质进行了创新,同时对抗性基因进行了染色体定位和分子标记[4]。赵环环获得了小麦抗白粉病基因G288连锁的SSR标记,标记位于普通小麦1A染色体上 [5]。王春梅利用分子标记技术对小麦抗条锈病基因Yr26进行了定位研究[6]。Spielmeyer等的研究获得了与Yr18小麦抗条锈基因紧密连锁的SSR标记[7]。Gupta等利用RAPD标记得到了与抗叶锈基因J r9紧密连锁的标记S5550,遗传距离为0.8 cM[8]。
2.1.2在抗非生物胁迫方面的应用
在生产过程中小麦产量往往会受到一些不可避免的环境因素的影响,造成大量减产,这些因素包括干旱、盐碱地、低温、高温等因素,因此增强小麦对这些因素的抵抗力或将跟这些因素有关的基因的聚集而达到提高小麦产量的目的也是植物育种工作者研究的重要方向。尤艳荣对小麦抗干热风相关性状进行了QTL分析,获得了一些SSR分子标记,并参考已有的小麦SSR标记绘制了遗传图谱,为研究小麦抗干热风遗传基础的研究提供了依据[9]。鞠丽萍等开发了与干旱胁迫应答反应相关的铁结合蛋白的分子标记 [10]。单雷等利用SSR-BSA方法在小麦体细胞杂种山融3号品种中筛选到了与耐盐性状连锁的SSR标记Xgwm304[11]。
2.1.3在小麦品质育种方面的应用
获得高品质的小麦也是人们十分关注的。小麦品质与高分子量麦谷蛋白亚基、低分子量麦谷蛋白亚基、醇溶蛋白、小麦淀粉和籽粒硬度等因素有关[12]。Briney等获得了与日本Udou面条品质相关的分子标记,能在种子或幼苗期对小麦品种的品质进行快速而准确地鉴定,从而加快了相关小麦品种的选育工作[13]。
2.2在其他方面的应用
分子标记技术除了在小麦育种中有广泛的应用,同时在小麦基础研究中也有很重要的作用,例如种质资源鉴定、亲缘关系鉴定及分类、遗传图谱构建和基因定位等方面。
2.2.1种质资源鉴定
分子标记技术在种质资源的开发、鉴定和评价中的应用也是非常广泛的,传统的种质资源鉴定方法往往需要足够量的田间小区和重复次数,这样对人力和财力都造成很大的浪费,根据小麦生长期的要求还需要大量的时间。虽然有的地方保存了许多种质资源而真正用于育种的却不多,而分子标记技术可以从DNA水平进行有效而快速地鉴定,为合理利用种质资源提供了依据。SSR标记可用于检测了小麦种子的纯度[14],从而可以指导生产实践,避免田间小麦层次不齐。王立新等探索了利用分子标记准确鉴定小麦品种种子纯度的技术体系,并提出了合理利用核心引物（7对SSR引物、5对EST-SSR引物和3对AFLP-SCAR引物）和合理混合DNA样品的方法提高种子纯度检测的效率、有效降低检测成本[15]。
2.2.2亲缘关系鉴定和系统分类
分子标记能鉴定物种系统演化和种间的亲缘关系。王珊珊等利用SSR标记反映了小麦骨干亲本“矮孟牛”及其衍生品种间的亲缘关系及遗传差异[16]。Lrlley等利用SSR标记清晰地区分了来自德国、澳地利和匈牙利三个国家的小麦品种,他们从每个国家分别取20个小麦品种,其中10个为食用小麦品种,另外10个为饲用小麦品种,并通过聚类分析将来源于同一国家的食用小麦和饲用小麦分开[17]。
2.2.3遗传图谱的构建
王心宇通过RAPD技术利用随机引物OPV20在提莫菲维小麦渐渗系IGVI-463中稳定产生OPV20-(2000)多态性片段,进而确定该标记与Pm6基因间的遗传距离为3.0±2.2cM,并利用ISSR标记在小麦种内进行指纹图谱构建和亲缘关系的鉴定[2]。
3.问题与展望
分子标记技术已经在小麦辅助育种、种质资源鉴定、基因定位、遗传图谱构建等方面得到了广泛的应用,显示出了强大的生命力,但还是存在一些不足之处,主要表现在[18]：分子标记与主流育种项目没有真正紧密结合,往往是育种工作和目标基因的标记相分开；小麦遗传图谱饱和度低,可用位点少,尤其是优良性状相关的标记就更少；各种分子标记在小麦中的应用不平衡,主要是RFLP、SSR、RAPD、STS标记而其他标记应用较少。尽管存在这些问题,但我们也利用分子标记辅助育种技术取得了可喜的成绩。随着分子标记技术理论与技术的进一步完善,小麦中越来越多地分子标记的开发,小麦遗传图谱饱和度的提高,以及分子标记技术与常规育种进一步结合,小麦中将会聚集更多地优良农艺性状,大大缩短育种进程。

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