第4章微生物细胞破碎作业答案.doc

第4章 微生物细胞破碎 作业参考答案

一 名词解释
细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。
化学渗透法：某些化学试剂，如表面活性剂、有机溶剂、金属螯合剂等可以改变细胞壁或细胞膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。

二 填空题
1 （ 肽聚糖 ）是细菌细胞壁的主要化学成分；酵母细胞壁的主要成分是（ 葡聚糖 ）；霉菌细胞壁主要由多糖组成，其中大多数的多糖壁是由（ 几丁质 ）和葡聚糖构成的。
2 细胞破碎的目的是释放出细胞内目的产物，方法很多。按其是否使用外加作用力可分为（机械法）和（非机械法）两大类。
3 机械法主要有（珠磨法）、（高压匀浆法）、（超声破碎法）和X-press法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用（冷却）措施，以防止生物产品受热破坏。
4 非机械法有（酶溶法）、（化学渗透法）、物理法和干燥法等。
5 细胞破碎率测定方法主要有（直接测定法）、（目的产物测定法）和（导电测定法）三种。

三 判断题
1 细胞壁破碎的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键（ √ ）。
2 革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌细胞壁要薄。（ X ）

四 简答题
1 细菌、酵母、霉菌细胞壁的主要成分。
答：细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的。
1）细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；主要阻力—肽聚糖的网状结构。
2）酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30％一34％)、甘露聚糖(30％)、 蛋白质(6％一8％)和脂类；主要阻力—壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
3）霉菌细胞壁主要化学成分：几丁质和葡聚糖；主要阻力—几丁质或纤维素的纤维状结构。

2 影响细胞壁破碎难易程度的主要因素。
答：微生物细胞壁的形状和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。破碎细胞要克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。
在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎程度的重要因素。细胞壁结构与细胞破碎关系：细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。
在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成显得特别重要，特别是细胞壁的结构。

五 论述题
1 论述细胞壁破碎常用的五种方法。
答：细胞壁破碎常用的五种方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、酶溶法和化学渗透法。
1）珠磨法：利用进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎释放出内含物。
优点：珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，在适当条件下一次操作即可达到较高的破碎率，适合于各种微生物细胞的破碎。
缺点：操作参数多，一般凭经验估计，在大规模操作中，夹套冷却控温难度大。
2）高压匀浆法：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。
优点：操作参数少，适合于大规模操作，
缺点：不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌。破碎率较低，往往需循环2-4次才能达到较高的破碎率，容易引起产物的失活的可能性，需配备换热器进行级间冷却。
3）超声破碎法：通常采用的超声破碎机在15—25kHz的频率下操作。
优点：操作简便，液量损失少，适合实验室规模。
缺点：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递和散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。
4) 酶溶法：利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。
优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄漏量少，细胞外形完整。
不足：价格高，限制了大规模应用，通用性差，不同菌种需选择不同的酶，不易确定最佳的溶解条件；产物抑制的存在。
5)化学渗透法：某些化学试剂如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、变性剂等通过改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁的结构与组成。
优点：(1)对产物释放具有一定选择性。 (2)细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。
缺点： (1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 (2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过 50％ 。(3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中需设法分离除去。
2 在微生物细胞破碎技术中，机械法与非机械法有什么不同。
答：破碎方式分为机械法与非机械法。机械法包括以固体剪切力作用为机理的珠磨法与压榨法，以液体剪切力为作用机理的高压匀浆和超声波破碎法。非机械法包括干燥处理手段和以溶胞作用为机理的酶溶法、化学法、物理法。二者相比各有特点，同时也有自身局限性，以下是二者之间的不同。
（1）破碎机理：机械法应用高压或研磨剂，使细胞悬液在加速碰撞下迅速破碎，应用剪切作用，相对剧烈的切碎细胞，而非机械法运用化学试剂对细胞壁和膜的作用，改变通透性，以溶解局部壁膜的温和方式。
（2）碎片大小：机械法通过高压碰撞，剪切磨损 已将细胞打成细小碎片，以至于匀浆中成分复杂，不易分离胞内物。非机械法只作用于细胞表面，所以在细胞大小方面，碎片较大，外形较完整，碎片少，易于初步分离。
（3）内含物释放：机械法可以将内含物全部释放，而非机械法部分释放，由微生物结构特性以及不同细胞对化学渗透剂的不同作用所致，破碎难易度不同，对试剂作用不同。
（4）黏度：核酸释放的多少影响到黏度。机械法释放的核酸多，黏度高，非机械法基本不破坏细胞核因此核酸释放少，浆液黏度低，便于进一步提取。
（5）时间效率：机械法作用时间短，效率高。而非机械法作用时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过百分之五十，而处理时间则长达2小时以上，所以往往需要添加还原剂保护，以防止活性损失太多，通常为提高收率而采用较高实际浓度，试剂用量大，成本高，也给后处理带来不便。
（6）设备：机械法需用专用设备如高压匀浆器，珠磨机。因此在工业生产上应用较广，而非机械法不需用专用设备，只须用化学试剂，控制好温度等条件既可。
（7）通用性：机械法通用性较强，除对仪器有堵塞作用如团状或丝状真菌以及较小的革兰阳性菌不适用高压匀浆器之外，一般大部分微生物细胞可采取机械法处理，而非机械法通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。
（8）经济方面：机械法只须用特定的仪器，控制条件方便 容易 变化不大，所以成本低。非机械法所用相应的化学试剂，培养时间长，成本高。
（9）应用范围：机械法适用于实验室，工业范围，非机械法适用于实验室范围。
机械法高效，廉价，简单，而得以工业化应用，但敏感性物质失活问题，碎片去除以及杂蛋白太多等问题仍要解决。