高中生物5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段导学案新人教版选修.doc

选修1课时13 多聚酶链式反应扩增DNA片段
班级:__________姓名:__________设计人__________日期__________
课前预习 · 预习案
学习目标 1
1．体验PCR常规的分子生物学实验方法。
2．理解PCR的原理。
3．讨论PCR的应用。
自主梳理 1
1．PCR原理：
(1)概念：PCR，即________，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，是一种体外迅速________的技术。
(2)原理。
①DNA变性：在________的温度范围内，________解体，双链分开的过程。
②DNA复性：当________后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链的过程。
③DNA合成：DNA聚合酶从引物的________开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的________向________延伸。
(3)条件

2．PCR的反应过程：
(1)循环次数：一般是________次。
(2)过程。
①变性：当温度上升到________时，双链DNA________。
②复性：温度下降到________，两种引物通过________与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到________，溶液中的四种脱氧核苷酸在________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(3)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈________扩增。
3．PCR的实验步骤：
准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
↓
移液：用________按照配方在微量离心管中依次加入各组分
↓
混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液________
↓
离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在________
↓
反应：将离心管放入________中，设置程序进行反应
4．PCR的操作提示：
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的一些用具及缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行________。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应________，并在________下储存。
(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都________。所有成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁， 使反应液________。
5．DNA含量的测定：
稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
↓
对照调零：以________作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
↓
测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm 处的光吸收值
↓
计算：DNA含量(μg/mL) =________________________
预习小测 1
1．判断正误：DNA聚合酶能延伸子链的3＇端或5＇端。
2．判断正误：PCR反应始终在高于70 °C的条件下进行。
3．判断正误：Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加。
4．判断正误：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。
5．判断正误：高压灭菌的微量移液器枪头每吸取一种试剂后不需要更换。
6．判断正误：做PCR使用的微量离心管是一种薄壁玻璃管。
♒♒♒♒♒♒♒知识拓展 · 探究案♒♒♒♒♒♒♒
探究1PCR技术的基本原理及条件 1
1．PCR技术的概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种________迅速________________的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。
2．PCR技术的原理：
(1)DNA的热变性
在________°C的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，________分开，这个过程称为________。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
(2)子链的合成
①需要________；②合成方向总是从子链的________________。
3．PCR技术的条件

(1)__________模板。
(2)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种__________。
(3)四种脱氧核苷酸。
(4)耐热DNA聚合酶，一般用__________DNA聚合酶。
(5)需要一定的__________和能严格控制__________的温控设备。
4．PCR扩增方向：
为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(一0H)末端称为3'端，而磷酸基团的末端称为5'端。DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3'端延伸DNA 链，即DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。
5．PCR原理——DNA的热变性原理

通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上是一台能够自动控制温度的仪器。
6．Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生嗜热菌Taq中分离提取的。Taq是一种嗜热细菌，能在70〜75°C环境中生长， 该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中发现的。TaqDNA聚合酶的发现解决了高温使普通的DNA聚合酶失活的矛盾。
典例精析 1
(PCR的原理)下列关于DNA 复制和PCR技术的叙述，正确的是
A.两者都能使DNA扩增，反应条件基本相同，即模板、原料及所需酶相同
B.前者所需引物是DNA单链，后者所需引物是RNA 单链
C.两个过程中所需的DNA聚合酶是完全相同的物质
D.PCR技术中，DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸
变式训练 1
如果在案件侦破过程中，搜集到一根毛发，但它所含的遗传信息量太少，该怎么办呢？
探究2PCR的反应过程及实验操作与评价 1
7．PCR的反应过程
(1)过程
PCR—般要经历30多次循环，每次循环可以分为_______、_______和_______三步，所需要的温度分别约为:________°C、________°C、_______°C。从第二轮循环开始，上一次循环的产物作为模板，参与反应，并且由_______延伸而成的DNA单链会与_结合进行DNA的延伸。
(2)结果
DNA聚合酶能特异的复制处于______________的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_______扩增。
8．PCR的实验操作：
(1) 实验用具
①PCR仪:该仪器能自动调控______________，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
②微量离心管：总容积为_______，实际上是进行______________的场所。
③微量移液器：用于_______PCR配方中的液体。
(2)操作步骤
准备→加入组分→混合→______________→反应
(3)操作提示
①为避免___________等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行___________。
②所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在一20 aC储存。
③在___________中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
9．DNA含量的测定
(1)测定方法
紫外分光光度计法。
(2)步骤
①反应液稀释：取2 μL_________反应液，添加98 μL________。
②分光光度计调零:将100_________添加到_________中，在________处将分光光度计读数调整为________。
③将100 μL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260 nm处的光吸收值。
④计算：DNA含量(μg/mL) =__________________。
10．PCR反应的条件
(1)稳定的缓冲液环境
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中，提供DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶。
(2)能严格控制温度变化的温控设备
11．PCR的反应过程
(1)变性
在80〜100 °C条件下，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

(2)复性
在25〜65 ℃条件下，系统温度降低，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合，形成局部双链。
(3)延伸
在70〜75℃条件下在Taq DNA聚合酶(在72 ℃左右活性最高)的作用下，以溶液中的四种脱氧核苷酸为原料，从引物的5'端到3'端方向延伸，根据碱基互补配对原则合成与模板链互补的DNA链。
特别提醒:PCR的结果
(1)PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作模板参与反应，并且由引物I延伸而成的DNA单链会与引物II结合，进行DNA 的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增。
(2)PCR—般要经历30多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为230。
12．PCR反应的实验操作
(l)PCR仪
PCR仪自动化程度较高，参照下表设计程序即可。
循环数
变性
复性
延伸
第1次
94 ℃ ,5 min
―
―
30次
94 ℃，30 s
55℃，30 s
72 °C,1 min
最后一次
94 °C , 1 min
55 ℃,30 s
72 ℃，1 min
若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替。三个恒温水浴锅的温度分别为94℃、55 ℃和72℃，然后按照上表要求， 在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)操作步骤
准备:按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验
↓桌上
移液:用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各
↓组分
混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
↓
离心:将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是
↓使反应液集中在离心管底部
反应:将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应

(3)实验中DNA含量的测定
理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2"，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。
13．PCR技术的实验操作评价
如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有:漏加了 PCR的反应成分，各反应成分的用量不当， PCR程序设置不当等。
特别提醒：PCR反应体系的配方是经多次实验后确定的， 各种成分的用量基本能满足实验反应需要。实验时，不要过多增加用量，以免造成浪费。PCR的反应成分包括稳定的缓冲液环境、DNA模板、两种引物、脱氧核苷酸混合液、Taq DNA聚合酶。
典例精析 1
标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是
A.95°C、55°C、72 °C
B.72 °C 、55 °C 、95 °C
C.55 °C 、95 °C 、72°C
D.80 °C 、55 °C 、72 °C
变式训练 1
使用PCR仪的具体实验操作顺序应为
①设计好PCR仪的循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④①
B.①⑤③②④
C.②③⑤①④
D.④②⑤③①
随堂自测 1
1．下列说法不正确的是
A.一条DNA母链只有一个3'端，即羟基末端
B.DNA的两个3'端位于相反的两端
C.Tag DNA聚合酶只能与引物的3'端结合并延伸子链
D.DNA的合成方向是从子链3'端向5'端延伸的
2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是
A.92℃、50℃、72℃
B.72℃、50℃、92℃
C.50℃、92℃、72℃
D.80℃、50℃、72℃
3．在DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是

4．假设PCR反应中有2个DNA的片段作为模板，在5次循环后反应物中大约有多少个这样的DNA片段
A.64
B.32
C.16
D.8
5．聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述30多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是
A.95℃高温破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C.延伸过程中需要热稳定DNA聚合酶和四种dNTP (合成DNA的原料)
D.引物为一小段RNA
6．如图为DNA变性和复性示意图，下列相关说法正确的是

A.向右的过程为加热(80〜100℃)变性
B.向左的过程是DNA双链迅速致冷复性
C.变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同
D.图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3'端
7．PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答问题。

(1)A过程高温使DNA变性解聚，对该过程的原理叙述，正确的是________。
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是________________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以________加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：______________。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94℃→55→72℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占________。
探究归纳 1
特别提醒:PCR技术与体内DNA复制的比较(见下表)
比较项目
细胞内DNA复制
PCR技术
不同点
解旋
在解旋酶作用下边解旋边复制
80〜100 °C高温解旋，双链完全分开
酶
DNA解旋酶、DNA 聚合酶
Taq DNA聚合酶
引物
RNA
DNA或RNA
温度
体内温和条件
高温
次数
受生物体自身控制
循环30多次
相同点
① 需提供DNA复制的模板
② 四种脱氧核苷酸作原料
③ 子链延伸的方向都是从5'端到3'端
选修1课时13 多聚酶链式反应扩增DNA片段
    详细答案   
课前预习 · 预习案
【自主梳理】
1．(1)多聚酶链式反应     扩增DNA片段
(2)①80〜100°C    DNA的双螺旋结构    ②温度缓慢降低    ③3＇'端
5＇端    3＇'端
(3)DNA的两条单链    两种引物脱氧核苷酸   耐热   TaqDNA聚合酶
2．(1)三十多
(2)①90 °C以上   解聚为单链    ②50°C左右  碱基互补配对  ③72°C左右  DNA聚合酶
(3)两个引物  指数
3．微量移液器    混合均匀    离心管底部    PCR仪
4．(1)高压灭菌   (2)分装成小份  -20°C    (3)必须更换  混合均匀
5．蒸馏水    50×(260 nm的读数)×稀释倍数
【预习小测】
1．×
2．×
3．×
4．√
5．×
6．×
♒♒♒♒♒♒♒知识拓展 · 探究案♒♒♒♒♒♒♒
【探究1PCR技术的基本原理及条件】
1．体外扩增  DNA片段
2．(1)80〜100   双链   变性     (2)①引物   ②5'端向3'端延伸
3．(l)DNA   (2)引物  (4)耐高温的Tαq   (5)缓冲溶液 温度
【典例精析】
D
【变式训练】
用PCR技术扩增DNA片段，短时间内就能扩增出足量的DNA，供分析研究和检测鉴定。
【探究2PCR的反应过程及实验操作与评价】
7．(1)变性 复性 延伸 95   55   72   引物I   引物II     (2)两个引物之间 指数
8．(1)①温度 ②0.5mL 多聚酶链式反应  ③转移   (2)设置PCR的循环程序   (3)①外源DNA 高压灭菌 ③微量离心管
9．(2)①PCR 蒸馏水 ②蒸馏水 比色杯 260 nm 零  ④50× (260 nm的读数) ×稀释倍数
【典例精析】
A
【解析】无
【备注】无
【变式训练】
C
【解析】PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器,设计好循环程序就可以进行反应了。故C正确。
【备注】无
【随堂自测】
1．D
2．A
3．C
4．A
5．D
6．A
7．(1)C
(2)DNA聚合酶     一次    不需要    DNA 模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等
(3)25%
【解析】PCR技术用高溫使DNA两条链解开，该过程不需要解旋酶的作用。C过程是链的延长，需要DNA聚合酶参与；PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等。循环3次共形成8个DNA分子，其中两个DNA分子含15N标记，占总数的25%。