微生物及无菌操作课件.pptx

学习是一本打开的书,你能从中看出未来的抱负 微生物及无菌操作微生物是什么n微生物是广泛存在于自然界的一群体形微小（直径小于1mm）、结构简单、肉眼看不见，必须藉助光学或电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的生物。需要说明的是，微生物是一个比较笼统的概念，界线有时非常模糊。如单细胞藻类和一些原生动物也应算是微生物，但通常它们并不放在微生物中进行研究。n微生物具有以下特点：体积小，面积大；吸收多，转化快（2000倍体重/h）；生长旺，繁殖快（20min分裂一次）；易变异，适应强；分布广，种类多（10万种以上）。Microorganismn我们所生活的环境中，到处都存在着大量的微生物。在一般空气中，微生物达8003500个/m3，在土壤中达1500108个/g，在严重污染的水中可达107个/ml。（饮用水要求细菌总数100个/ml，大肠杆菌3个/ml。经水塔或贮水池贮存后，短期内可繁殖至105106个/ml。）人的头皮上有140万个/cm2，两手上约有440万个，1g指甲污垢有38亿个，1g粪便可达101000亿个。可以说微生物是无处不在，无处不有。许多以前被人们认为是极端（高温、高压、强酸、强碱、低温等）甚至是致死的环境，现在已发现生活着各种类型的微生物（称为极端微生物）。事实说明，微生物有特别顽强的生存、繁殖和变异能力来适应环境。n微生物种类繁多，有的对人有益，有的有害，有的无益也无害。但在药品生产过程中，不可能对环境中的各种微生物加以区别对待，为保证药品的安全有效，需要对其进行控制。空气中的微生物多数附着在灰尘上，或以芽孢形式悬浮于空气中，1m以下者处于悬浮状态，10m以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。所以也要对尘粒进行控制。n大量临床资料表明，注射剂（尤其是静脉注射剂）如污染了712m的尘粒，可导致热原反应、肺动脉炎、微血栓或异物肉芽肿等，严重的还会致人死命。而如果污染了细菌，轻则局部红肿化脓，重则引起全身细菌性感染。因此，对微生物和尘粒进行更加严格的控制对于针剂生产洁净室非常重要。n人是洁净室最大的污染源，占90%左右。一般男性每人每分钟向周围排放1000个以上的含菌粒子，女性为750个以上。穿无菌服时，静止时的发菌量为10300个/min，一般活动时发菌量为1501000个/min，行走时发菌量为9002500个/min。咳嗽一次发菌量为70700个/min，喷嚏一次为400060000个/min。所以在洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。“无处不在的微生物”n1营养物：水分、碳源、氮源、无机盐类、生长因子。n2pH值：各种微生物都有其最适宜的pH值，大多数细菌最适pH为6.87.4，但一般有较大的容忍度，在49也可存活和生长，少数细菌能在极端pH值范围内生长。真菌适于pH值36的微酸性环境，但在210也可生长。n3温度：微生物适于生长繁殖要有适宜的温度，当超过其最低或最高可耐受的温度时，即停止生长或死亡。一般细菌最适温度为3040，真菌为2030。n4氧气：大多数细菌和所有霉菌都是需氧菌（在有氧环境中才能生长），少数细菌是厌氧菌（在无氧环境中才能生长），有些细菌和酵母菌是兼性需氧厌氧的，在有氧或无氧环境中都能生长繁殖。n5渗透压：微生物细胞膜和所有生物膜一样是一种半透膜，可让水自由通过，对溶质则有选择性。由于细胞壁的保护，微生物能存活在低渗透压的水中。而在高渗溶液（如高浓度的盐溶液或糖溶液、40%甘油）中，细胞会脱水并停止生长繁殖。但也有一些专性耐高盐细菌只有在高盐（1015%）条件下才生长。n6表面张力：表面活性剂可降低表面张力，它是影响细菌生长的因素之一。很多革兰氏阴性菌，特别是大肠菌群可很好地在表面活性剂包围的介质中生长，而大多数革兰氏阳性菌在表面张力低时（0.05N/m）不能很好生长。阳离子表面活性剂对很多有机体有毒性，阴离子表面活性剂毒性很小，非离子表面活性剂几乎没有毒性，并可成为某些微生物的营养物。“微生物生长的影响因素”洁净室的净化度标准Cleanliness of clean room洁净度级别尘粒最大允许数/m3微生物最大允许数 0.5m5m浮游菌/m3沉降菌/皿1003,50005110 000350,0002,0001003100 0003,500,00020,00050010300 00010,500,000 60,00015n灭菌：系指用物理或化学等方法杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的手段。n灭菌法：系指杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的方法或技术n无菌：系指在任一指定物体、介质或环境中，不得存在任何活的微生物。n无菌操作法：系指在整个操作过程中利用和控制一定条件，使产品避免被微生物污染的一种操作方法或技术n防腐：系指用物理或化学方法抑制微生物的生长与繁殖的手段，亦称抑菌。对微生物的生长与繁殖具有抑制作用的物质称抑菌剂或防腐剂。n消毒：系指用物理或化学方法杀灭或除去病原微生物的手段。对病原微生物具有杀灭或除去作用的物质称消毒剂。“灭菌方法与无菌操作”基本概念01目的n提高药物制剂的安全性n 保护制剂的稳定性n 保证制剂的临床疗效“灭菌方法与无菌操作”分类02灭菌法n物理灭菌法n化学灭菌法n无菌操作法n利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，n杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法。“物理灭菌法”1、干热灭菌法2、湿热灭菌法3、滤过除菌法4、射线除菌法系指在干燥环境中进行灭菌的方法。1、干热灭菌法火焰灭菌法干热空气灭菌法1.1火焰灭菌法n系指用火焰直接灼烧灭菌的方法。n该法适用于耐火焰材质（如金属、玻璃及瓷器等）的物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。1.2干热空气灭菌法n系指用高温干热空气灭菌的方法。n该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿气穿透的油脂类 （如油性软膏基质、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适于橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。系指用饱和蒸气、沸水或流通蒸气进行进行灭菌的方法。2、干热灭菌法热压灭菌法 煮沸灭菌法 流通蒸汽灭菌法 低温间接灭菌法2.1热压灭菌法n系指用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。能杀灭所有细菌繁殖体和芽孢，适用于耐高温和耐高压蒸汽的所有药物制剂 、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、滤膜过滤器等。灭菌温度（蒸气表压）和时间：115(67kPa)115(67kPa)、30min30min；121(97kPa)121(97kPa)、20min20min；126(139kPa)126(139kPa)、15min15min系指采用过滤法除去微生物的方法。该法属于机械除菌方法，该机械称为除菌过滤器。该法适用于对热不稳定的药液、气体、水等物品的灭菌。对灭菌用过滤器应有较高要求。常用的除菌过滤器：0.22m的微孔滤膜器和G6垂熔玻璃滤器。3、滤过除菌法系指采用辐射、微波和紫外线杀灭微生物和芽孢的方法。4、射线灭菌法辐射灭菌法 微波灭菌法 紫外线灭菌法 4.1紫外线灭菌法nUV200-300nm,254-257nmUV200-300nm,254-257nm最强n原理 1 1、促使核酸蛋白变性，2 2、使产生臭氧，共同杀菌后n用于空气灭菌和表面灭菌；效果与微生物敏感性有关，对酵母或霉菌力弱紫外线的杀菌效果Bactericidal effect of ultraviolet raysn系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法。n杀菌剂是指对微生物具有触杀作用的化学药品。分为气体杀菌剂和液体杀菌剂。n杀菌剂只对微生物繁殖体有效，不能杀灭芽孢。n杀菌效能决定于微生物的种类与数量、物体表面光洁度或多孔性以及杀菌剂的性质等。“化学灭菌法”n该法适用于环境消毒和不耐热的医用器具、设备和设施等的消毒，亦用于粉末注射剂的消毒。n常用的气态杀菌剂：环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸。“气体灭菌法 ”n该法常作为其他灭菌法的辅助措施，适用于皮肤、无菌器具和设备的消毒n常用的消毒液有：75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.10.2%新洁尔灭溶液、酚或煤酚皂溶液等。“药液灭菌法”n系指整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。n该法适用于一些不耐热药物的注射液、眼用制剂、皮试液、海绵剂和创伤制剂的制备.“无菌操作法”无菌操作室的灭菌 无菌操作 1、无菌操作室的灭菌n 常采用紫外线、液体和气体灭菌法对无菌操作室环境进行灭菌。n常用甲醛溶液加热熏蒸法 液态甲醛 气体发生装置（蒸气加热夹层锅）甲醛蒸气鼓风机湿度60%温度25无菌室关闭熏蒸1224h25%氨水除气2、无菌操作n无菌操作的场所：无菌操作室、层流洁净工作台、无菌操作柜。n无菌操作的所用物品：器具、环境n操作人员即操作环境中的物体表面、空气中除了你瓶中培养的微生物，没有其它活的微生物，确保培养菌的纯净。主要有紫外线空即操作环境中的物体表面、空气中除了你瓶中培养的微生物，没有其它活的微生物，确保培养菌的纯净。主要有紫外线空气杀毒、喷洒灭菌水在无菌室、酒精灯火焰操作。气杀毒、喷洒灭菌水在无菌室、酒精灯火焰操作。无菌操作无菌技术是在医疗护理操作过程中，保持无菌物品、无菌区域不被污染、防止病原微生物 侵入人体的一系列操作技术。无菌技术作为预防医院感染的一项重要而基础的技术，医护人员必须正确熟练地掌握，在技术操作中严守操作规程，以确保病人安全，防止医源性感染的发生。无菌操作的概念1.无菌技术无菌技术（aseptic technique）是指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。2.无菌物品无菌物品(aseptic supply)经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品称无菌物品。3.无菌区域无菌区域(aseptic area)经过灭菌处理而未被污染的区域，称无菌区域。4.非无菌区非无菌区(non-aseptic area)未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌物品或区域。5.相对无菌区相对无菌区(relative aseptic area)相对无菌区指无菌物品自无菌容器内一经取出，就认为是相对无菌，不可再放回。无菌区边缘向内3cm为相对无菌区。6.污染物品污染物品(infectant)污染物品指未经过灭菌处理，或灭菌处理后又被污染的物品。原则1.操作前准备操作前准备（1）操作环境应清洁、宽敞、定期消毒；物品布局合理；无菌操作前半小时应停止清扫工作、减少走动、避免尘土飞扬。（2）工作人员应做好个人准备，戴好帽子、口罩，修剪指甲并洗手，必要时穿无菌衣、带无菌手套。2.操作中保持无菌操作中保持无菌（1）工作人员应面向无菌区，手臂应保持在腰部或操作台台面以上，不可跨越无菌区避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。（2）用无菌持物镊取用物品；无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回无菌容器内；一套无菌物品仅供一位患者使用，避免交叉感染。（3）无菌操作中，无菌物品疑有污染或已被污染，应予更换并重新灭菌。3.无菌物品保管无菌物品保管（1）无菌物品必须与非无菌物品分开放置。（2）无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器中，无菌包外须标明物品名称、灭菌日期，并按失效期先后顺序排放。（3）定期检查无菌物品的灭菌日期及保存情况。无菌包在未被污染的情况下保存期一般为7天，过期或受潮应重新灭菌。无菌操作有何意义做到三重保护，1、无菌操作本身保证样品的真实性，避免对样品的污染；2、无菌操作同时也包括了对操作者的要求，因此也保护了操作者本身的安全；3、无菌操作一般都是在特定的生物安全柜进行，这样也利用了生物安全柜的特性，保证操作中形成的气溶胶不会扩散到环境中，因此也是对环境的保护。洗手 涮手 消毒手1.洗手 执行无菌操作、取用清洁物品之前，护理病人前后，接触污染物之后均应洗手。方法：用肥皂搓洗手掌、手背、指间、手指及关节，以环形动作搓擦。而后用流水冲洗双手，将皂沫全部冲净，必要时反复冲洗，最后用清洁小毛巾擦干双手。2.涮手 即利用机械及化学作用去除手上污物及微生物的方法，是做好消毒隔离、预防交叉感染的重要措施。方法：取无菌刷蘸肥皂乳（或肥皂块），先刷指尖、然后刷手、腕、前臂、肘部到上臂下1/2段，特别要刷净甲沟、指间、腕部，无遗漏地刷洗三遍，每遍3分钟。刷洗时，双手稍抬高。每遍刷完后，用流水冲去肥皂沫，水由手、上臂至肘部淋下，手不能放在最低位，以免臂部的水返流到手。刷洗毕，用无菌小毛巾依次拭干手、臂。手、臂不可触碰其它物品，如污染必须重新刷洗。3.消毒手 消毒液泡手能有效地去除手上的微生物。方法：刷洗后，双手及上臂下1/3伸入盛有消毒液的桶内，用无菌小毛巾轻擦洗皮肤5分钟，手不可触及桶口。浸泡毕，拧干小毛巾，揩去手、臂、消毒液，晾干。双手保持于胸前半伸位准备穿手术衣。n1 空气培养n2 无菌采集护士手样n3 口腔中细菌培养n4 手机上细菌培养n5 钱包上细菌培养 注：每组5个培养基 实验分组-5组 n1室内清洁、干燥的条件下进行空气采样，并关上门窗。n2紫外线消毒照射60分钟最佳，关闭后30分钟内完成。（以清晨采样为最佳）n3琼脂平皿放置位置，离地面0.8-1.5m，距墙1m。n4采样点：房间面积大于30平方米的取个点。n5将平皿打开后，盖子倒扣在平皿边缘（盖子不可朝天）暴露5分钟后加盖。n6每个平皿做好标记，写上地点及标志，检验目的是为空气培养。空气培养采样方法 n1洗手七步法：用肥皂反复洗手，自然晾干，用无菌干拭子从一只手大拇指的第二节根部至手的中指尖，正反两面来回涂擦10次，每只手的检测面积为100c.然后涂布方式进行。n2平板手印法：打开平皿用要检测的手直接轻轻按下即可，盖好平板 无菌采集手样本 n1传统的棉拭子法：用无菌的棉拭子在口腔中对应的左上、坐下、右上、右下四个方位采集。n2用生理盐水漱口后同样方法检测。n3采集的位置：口腔侧壁，牙龈、沟。口腔中细菌采集n1用无菌棉签擦拭手机的正面、方面和侧面，然后将棉签在培养基上做涂布法涂布。n2将手机用75的酒精擦拭后再用无菌棉签擦拭，再将棉签进行涂布法涂布。手机上细菌采集n直接将纸币在培养基上轻轻按上即可。n用75的酒精擦拭钱包表面，再用无菌棉签擦拭再在培养基上做涂布。n直接用无菌棉签擦拭钱包表面直接涂布。钱与钱包上的细菌采集Thanks显微镜下区别细菌和真菌显微镜下真菌和细菌的形态差别还是很明显的，细菌一般都要经过染色之后才能观察。而真菌个体要大些，产孢结构明显，孢子链形态多样，有串生、簇生、帚状枝等等，所以一般都能够直接观察。如果要更细致的观察我们就要：因为实验室一般常用普通的光学显微镜。但是由于细菌体积小且透明，活体细胞内含有大量水分，因此，对光线的反射与吸收差别不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难以看清他们的形状，更谈不上其细微结构。经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地观察微生物的形状和结构，亦即菌体表面及内部结构着色与背景成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜观察形态和结构，而且还可以通过不同染色反应来区别微生物类型以及死.活细菌。因此，必须用染色的方法来区别。