微生物检测2.pptx

第二节第二节 沙门菌检查法沙门菌检查法n美美国国细细菌菌学学家家SalmonSalmon与与SmithSmith于于18851885年年分分离离出出猪猪霍霍乱乱沙沙门门菌菌。19901990年年为为纪纪念念SalmonSalmon，定定名名这这类类细细菌菌为为沙沙门菌属。门菌属。n沙沙门门菌菌是是肠肠杆杆菌菌科科的的重重要要致致病病菌菌。包包括括伤伤寒寒、副副伤伤寒寒甲甲、乙乙、丙丙型型，肠肠炎炎，鼠鼠伤伤寒寒等等沙沙门门菌菌，现现今今已已发现发现2 2324324个血清型。个血清型。n在在世世界界各各地地的的食食物物中中毒毒中中，沙沙门门菌菌食食物物中中毒毒常常占占首首位位或或第第二二位位。规规定定在在药药品品和和食食品品中中不不得得检检出出沙沙门门菌菌。美美国国每每年年报报道道病病例例45 45 000000个个左左右右，实实际际数数量量可可能能多多达达200-300200-300万。伤寒每年万。伤寒每年400-500400-500例。例。一、生物学特性一、生物学特性1 1.形态形态 两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，（0.4-0.90.4-0.9）m m (1-3)(1-3)m m，无无芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少数有包膜。少数有包膜。光滑型的细菌大小均匀，粗光滑型的细菌大小均匀，粗糙型则大小不一，长短不一。糙型则大小不一，长短不一。2 2.培养特性培养特性n在营养琼脂平板上在营养琼脂平板上18-2418-24h h培养形成无色半透明，表培养形成无色半透明，表面面光滑、湿润、隆起光滑、湿润、隆起的菌落，直径的菌落，直径2-32-3mmmm。有些菌株有些菌株在营养琼脂平板上生长不良，形成在营养琼脂平板上生长不良，形成 “侏儒侏儒”菌落，菌落，加葡萄糖或甘油，生长良好，但易使菌株粗糙加葡萄糖或甘油，生长良好，但易使菌株粗糙,呈呈干燥、无光泽、边缘不整齐干燥、无光泽、边缘不整齐。n光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀；粗糙型则产生光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀；粗糙型则产生沉淀，上层液透明。沉淀，上层液透明。n生长温度在生长温度在10-4210-42，最适，最适3838；pH4.5-9pH4.5-9，最适最适pHpH6.8-7.86.8-7.8；需氧或兼性厌氧。；需氧或兼性厌氧。3 3.生化特性生化特性n靛基质靛基质-，甲基红，甲基红+，v-p-v-p-，柠檬酸盐反柠檬酸盐反应应d d，产硫化氢，尿素酶反应产硫化氢，尿素酶反应-，还原硝，还原硝酸盐，酸盐，-葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶d d，不能发酵不能发酵乳糖，可以被噬菌体裂解。乳糖，可以被噬菌体裂解。4 4.抗原结构抗原结构（1 1）抗原构造）抗原构造n菌菌体体抗抗原原（o o）：不不被被乙乙醇醇、0.1%0.1%石石炭炭酸酸所所破破坏坏。与与特特异异性性抗抗血血清清呈呈颗颗粒粒状状凝凝集集，形形成成慢慢，不不易易摇摇散散。现现已已知知有有5050多多种种，多多数数沙沙门门菌菌含含有有两两种种以以上上的的O O抗抗原原，有有的的O O抗抗原原是是一一种种菌菌独独有有的的，有有的的是是几几种种菌菌共共有有的的，凡凡含含有有共共同同特特异异性性抗抗原原成成分分的的血血清清型型归归为为一一个个群群，可可将将沙沙门门菌菌化化分分为为4242群群，按按A-ZA-Z排排列列，Z Z以以后后的的顺顺序序以以O O5151-O-O6767表表示示。引起人类沙门菌病的引起人类沙门菌病的95%95%以上都在以上都在A-F 6A-F 6个群内。个群内。n表表面面抗抗原原（K K抗抗原原）：沙沙门门菌菌中中有有三三种种K K抗抗原原，即即ViVi抗原、抗原、M M抗原和抗原和5 5抗原。抗原。q可可阻阻止止O O抗抗原原被被抗抗O O血血清清所所凝凝集集，具具有有O O不不凝凝集集性。常用于菌型鉴定。性。常用于菌型鉴定。qM M抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊意义。抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊意义。q5 5抗原：抗原：n鞭鞭毛毛抗抗原原（H H抗抗原原）：经经乙乙醇醇或或酸酸处处理理后后失失去去与与特特异异性性抗抗体体的的结结合合力力。制制备备时时，应应用用具具有有丰丰满满鞭鞭毛毛的的菌菌种种18-2418-24h h的的培培养养物物，加加甲甲醛醛固固定定或或6060以以下下加加热热后后即即成成H H抗抗原原。H H抗抗原原与与抗抗H H血血清清562562h h后后，可可出出现疏松易于摇散的絮状凝集。现疏松易于摇散的絮状凝集。沙沙门门菌菌的的H H抗抗原原有有两两相相，特特异异性性高高的的称称为为第第1 1相相（特特异异相相）抗抗原原；特特异异性性低低的的称称为为第第2 2相相（非非特特异异相相）抗抗原原；多多数数沙沙门门菌菌同同一一菌菌株株，常常可可分分离离出出两两种种H H抗抗原原的的菌菌落落，菌菌落落的的外外观观性性状状完完全全一一样样，但但与与相相应应抗抗体体作作凝凝集集反反应应时时则则明明显显不不同同。具具有有两两相相抗抗原原的的称称为为双双相相菌菌，仅仅有有一一相相抗抗原原的则称为单相菌。的则称为单相菌。（2 2）抗原变异）抗原变异Smooth-Transient-RoughSmooth-Transient-Rough变变异异：为为避避免免R R型型的的出出现现，保存培养基内不应含有糖类，不要多次移种传代。保存培养基内不应含有糖类，不要多次移种传代。V-WV-W（Vi-OVi-O）变变异异：具具有有ViVi抗抗原原的的菌菌株株称称为为V V型型菌菌，失失去去ViVi抗抗原原的的菌菌株株称称为为W W型型菌菌。W W型型菌菌只只能能同同其其相相应应的的O O型血清发生凝集，而不与型血清发生凝集，而不与ViVi血清凝集。血清凝集。HO-OHO-O变异：有鞭毛抗原的变异：有鞭毛抗原的HOHO型菌变为无鞭毛的型菌变为无鞭毛的O O型菌。型菌。位位相相变变异异：有有双双相相鞭鞭毛毛抗抗原原的的沙沙门门菌菌两两个个相相可可以以互互变变。通通常常在在一一个个培培养养物物内内二二相相并并存存，在在平平板板上上各各占占半半数数，但但挑挑取取单单菌菌落落，经经多多次次移移接接后后，又又出出现现两两相相各各半半现现象象，这这种种由由一一相相变变为为另另一一相相的的变变异异，称称为为位位相变异，单相菌不产生位相变异。相变异，单相菌不产生位相变异。5、发病机理和症状发病机理和症状n菌量大菌量大n活菌和菌体内毒素协同作用活菌和菌体内毒素协同作用n小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜，由淋巴，由淋巴系统进入血液系统进入血液n潜伏期潜伏期8-48hn急性期，每克粪便中沙门菌多至急性期，每克粪便中沙门菌多至10亿个亿个食物中毒的特征性症状食物中毒的特征性症状n腹泻腹泻n恶心恶心n腹痛腹痛n低烧低烧和寒颤寒颤n有时呕吐呕吐、头痛头痛、倦怠倦怠伤寒的典型症状伤寒的典型症状n持续发发热热39-40n昏睡昏睡症n剧烈腹痛腹痛（腹部痉挛痉挛）n头痛头痛n食欲不振n出现扁平的玫瑰红色点状红疹红疹（一）（一）检验程序检验程序供供试试品品供供试试液液预预增增菌菌增增菌菌DHLS.SEMBEMBMaCCMaCCTSI（三三糖糖铁铁琼琼脂脂）氰化钾氰化钾赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验尿素酶试验尿素酶试验吲哚试验吲哚试验血清学试验血清学试验半固体营养琼脂半固体营养琼脂革兰染色、镜检革兰染色、镜检报报告告二、沙门菌常规检查法二、沙门菌常规检查法1.1.预增菌预增菌:u将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养，将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养，使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌培养基中。培养基中。u一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用乳糖肉汤作预增菌液。以乳糖肉汤作预增菌液。以1 1：1010的比例接种，的比例接种，18-2418-24h,35-37h,35-37。预增菌培养基的选择预增菌培养基的选择培养基培养基商品商品缓冲蛋白胨水（缓冲蛋白胨水（BPW）使用于所有商品使用于所有商品BPW+酪蛋白酪蛋白巧克力巧克力乳糖肉汤乳糖肉汤蛋和蛋制品，火腿，蛋和蛋制品，火腿，pH6的着的着色食品色食品乳糖肉汤乳糖肉汤+表面活性剂表面活性剂7或曲拉通或曲拉通X-100椰肉，肉，干燥或加工过的动物椰肉，肉，干燥或加工过的动物食品食品乳糖肉汤乳糖肉汤+0.5%凝胶酶凝胶酶凝胶凝胶脱脂乳脱脂乳+亮绿亮绿巧克力，糖，糖衣巧克力，糖，糖衣胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆肉汤香料、香草、干酵母香料、香草、干酵母胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆肉汤+0.5%硫酸钾硫酸钾洋葱和蒜粉等洋葱和蒜粉等水水+亮绿亮绿奶粉奶粉2.选择性增菌选择性增菌n取取1 1mLmL预增菌液转种至增菌培养基预增菌液转种至增菌培养基1010mLmL。37372424h h，培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养基，我国与英国相同采用后者。美、日基，我国与英国相同采用后者。美、日采用二者联用有助于提高沙门菌的检出采用二者联用有助于提高沙门菌的检出率。率。转接到选择性转接到选择性培养基培养基免免疫疫 磁磁性性分分离离技技术术（Immunomagnetic separation，IMS）3.分离培养分离培养选择性培养基：选择性培养基：nDHLDHL：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色nHEHE：蓝绿或蓝色，产硫化氢的菌落中心黑色蓝绿或蓝色，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色nSSSS：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色n分分离离沙沙门门菌菌应应以以出出现现单单个个菌菌落落为为准准，否否则则应应重重新分离。新分离。n由由于于平平板板用用前前未未烘烘干干，或或因因分分离离不不良良菌菌落落连连片片均须重新分离。均须重新分离。n致致病病菌菌菌菌落落一一般般在在经经36243624h h培培养养后后，再再放放置置室室温温2-32-3天天后后不不发发生生变变化化，而而非非致致病病菌菌则则继继续续增生、增厚，并带黄灰色，并产生臭味。增生、增厚，并带黄灰色，并产生臭味。n对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍(1)(1)初步鉴别试验：初步鉴别试验：三糖铁琼脂三糖铁琼脂|乳糖乳糖:蔗糖蔗糖:葡萄糖葡萄糖=10:10:1|以酚红作指示剂以酚红作指示剂|当当待待检检菌菌发发酵酵乳乳糖糖或或蔗蔗糖糖时时，产产酸酸量量多多，使使整整个个培培养养基基均均呈呈黄黄色色；如如仅仅发发酵酵葡葡萄萄糖糖，则则产产酸酸少少，斜斜面面由由于于细细菌菌生生长长分分解解蛋蛋白白胨胨而而释释放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色|细细菌菌对对培培养养基基中中硫硫代代硫硫酸酸钠钠或或硫硫酸酸钠钠、亚亚硫硫酸酸钠钠的的还还原原作作用用，生生成成硫硫化化氢氢。硫硫化化氢氢遇遇硫硫酸酸亚亚铁铁或或柠柠檬檬酸酸铁铁铵铵产产生生不不溶溶性性黑黑色色硫硫化化亚铁。亚铁。4.生化试验生化试验斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色，无黑色斜面红色、底层黄色，无黑色斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色 除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可出现上述反应。出现上述反应。n 吲哚试验：阴性吲哚试验：阴性n志志贺贺氏氏菌菌都都能能分分解解葡葡萄萄糖糖，产产酸酸不不产产气气，大大多多不不发发酵酵乳乳糖糖，不不产产生生H H2 2S S。n大大肠肠杆杆菌菌，能能分分解解葡葡萄萄糖糖产产酸酸产产气气，大大多多数数能能分分解解乳乳糖糖，不不产产生生H H2 2S S。n沙沙门门氏氏菌菌，能能分分解解葡葡萄萄糖糖，不不发发酵酵乳乳糖糖、蔗蔗糖糖，大大多多数数产产生生H H2 2S S，多数产气。，多数产气。n下面照片所示下面照片所示2-3-42-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验纯培养菌落纯培养菌落赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶 产酸产酸含糖蛋白胨培养基含糖蛋白胨培养基溴甲酚紫溴甲酚紫产碱产碱(尸胺尸胺)CO2对照为黄色,阳性为紫色培养时间不超过四天伤寒和鸡沙门菌除外，均为阳性含糖蛋白胨培养基含糖蛋白胨培养基紫色紫色(3)尿素酶试验尿素酶试验n区别变形杆菌区别变形杆菌n具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生氨，培养基碱性，使酚红变素，产生氨，培养基碱性，使酚红变红。沙门菌反应红。沙门菌反应阴性阴性 注意注意：用无尿素的培养基作对照：用无尿素的培养基作对照 (4)氰化钾试验氰化钾试验n沙沙门门菌菌、志志贺贺菌菌和和埃埃希希菌菌的的生长受生长受KCN抑制。抑制。nKCN浓浓度度为为1：13300或或1：10000。n沙门菌此反应沙门菌此反应阴性阴性。待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物KCN培养基培养基3648h不生长不生长铁卟啉铁卟啉呼吸酶失活呼吸酶失活注意注意：u氰化钾的浓度氰化钾的浓度u控制接种量控制接种量u试管封口严密试管封口严密u操作谨慎操作谨慎u用用后后的的培培养养管管加加硫硫酸酸亚亚铁铁和和氢氧化钾去毒氢氧化钾去毒u对照不加对照不加KCN（5）动力检查）动力检查l沙门菌周生鞭毛，能运动。沙门菌周生鞭毛，能运动。l猪猪霍霍乱乱沙沙门门氏氏菌菌（S.gallinarumS.gallinarum）和和鸡鸡白白痢痢沙沙门门氏氏菌（菌（S.pullorumS.pullorum）没有运动性）没有运动性5.血清学凝集试验血清学凝集试验（1 1）沙门菌属诊断血清）沙门菌属诊断血清诊断血清规格：诊断血清规格：1010种种1 1套套：主主要要供供伤伤寒寒、副副伤伤寒寒沙沙门门菌菌初初步步诊诊断断用用。包包括括ViVi及及A-FA-F群群多多价价血血清清各各1 1种种；O O因子血清因子血清4 4种；种；H H 因子血清因子血清4 4种种2626种种1 1套套：主主要要供供沙沙门门菌菌常常见见菌菌型型定定群群和和初初步步定定型型用用。包包括括ViVi及及A-FA-F群群多多价价血血清清各各1 1种；种；O O因子血清因子血清9 9种；种；H H 因子血清因子血清1515种种5757种种1 1套套：主主要要供供沙沙门门菌菌常常见见菌菌型型定定型型用用。包包括括ViVi及及A-FA-F群群多多价价血血清清各各1 1种种；O O因因子子血血清清1616种种；O O复复合合因因子子血血清清各各1 1种种；H H 因因子子血清血清3131种；种；H H复合因子血清复合因子血清3 3种种144144种种全全套套：供供各各型型沙沙门门菌菌诊诊断断用用。包包括括诊诊断断各各型型沙沙门门菌菌用用的的各各种种多多价价O O、多多价价H H血血清和单因子及复合因子血清清和单因子及复合因子血清 群别群别菌种名称菌种名称O抗原成分抗原成分A甲型副伤寒杜雷佐变种甲型副伤寒杜雷佐变种(S.para Typhi A)2,12B里丁沙门菌里丁沙门菌(S.reading)4,12C1猪霍乱沙门菌猪霍乱沙门菌1350(S.cholerae-suis)6,7C2新港新港(纽波特纽波特)沙门菌沙门菌(S.newport)6,8D1伤寒沙门菌伤寒沙门菌0901(S.typhi)9,12E伦敦沙门菌伦敦沙门菌(S.London)3,10F阿伯丁沙门菌阿伯丁沙门菌(S.aberdeen)11A-F群O多价血清的代表菌株n根根据据沙沙门门菌菌菌菌型型调调查查结结果果，95%95%以以上上的的沙沙门门菌菌都都属属于于A-FA-F六六个个O O群群，常常见见菌菌型型不不过过2020个个左左右右，因因此此沙沙门门菌菌检检验验，主主要要是是对对A-FA-F群群沙沙门门菌菌做做出出初初步步鉴鉴定定。按按常常规规方方法法选选用用A-FA-F群群多多价价O O血清。血清。凝集试验方法凝集试验方法n二二者者比比例例适适当当，菌菌量量过过多多过过少均不易观察到正确结果。少均不易观察到正确结果。n 阳性反应通常在阳性反应通常在3 3minmin内发生。内发生。n血血清清效效价价低低反反应应迟迟缓缓时时，应应将将玻玻片片置置培培养养皿皿内内，放放一一个个湿湿棉棉球球，盖盖上上皿皿盖盖，经经约约2020minmin再观察结果。再观察结果。n出出现现凝凝集集现现象象的的待待检检菌菌培培养养物物，应应以以灭灭菌菌的的生生理理盐盐水水溶溶液液代代替替A-FA-F多多价价O O血血清清，与与培培养养物物混混匀匀做做对对照照试试验验，对对照照应应无无凝凝集集现现象象，方方可可判判为为阳阳性反应。性反应。A-F多价多价O血清血清稀释稀释接种环沾取接种环沾取2-3环环1.5cm0.5cm条形涂抹条形涂抹待检菌待检菌36 18-24h接种环刮取少许接种环刮取少许混匀 待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称自家凝集现象，这种现象多为自家凝集现象，这种现象多为S-RS-R所致。所致。当当A-FA-F多价多价O O血清凝集试验为阴性时，还血清凝集试验为阴性时，还应当考虑是否因为待检菌含有应当考虑是否因为待检菌含有ViVi抗原所致。抗原所致。3、结果判断及报告、结果判断及报告（1）生生化化试试验验符符合合沙沙门门菌菌属属反反应应，沙沙门门菌菌属属A-F多多价价O血血清清凝凝集集试试验验阳阳性性反反应应，做做出出供供试试品品检检出出沙沙门门菌菌报告。报告。（2）生生化化试试验验不不符符合合沙沙门门菌菌属属反反应应，沙沙门门菌菌属属A-F多多价价O血血清清凝凝集集试试验验阴阴性性反反应应，做做出出供供试试品品未未检检出出沙沙门菌报告。门菌报告。（3）生生化化试试验验符符合合沙沙门门菌菌属属反反应应，沙沙门门菌菌属属A-F多多价价O血血清清凝凝集集试试验验阴阴性性反反应应；或或生生化化试试验验不不符符合合沙沙门门菌菌属属反反应应，沙沙门门菌菌属属A-F多多价价O血血清清凝凝集集试试验验阳阳性性反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。n对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生化试验。化试验。糖醇发酵试验糖醇发酵试验明胶液化试验明胶液化试验硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验甲基红试验甲基红试验VPVP试验试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验丙二酸钠试验丙二酸钠试验有机酸盐利用试验有机酸盐利用试验甘油品红试验甘油品红试验明胶液化试验明胶液化试验被胶原酶分解被胶原酶分解判断结果前，冰箱冷却。判断结果前，冰箱冷却。明胶的用量与质量明胶的用量与质量肠杆菌科一般为阴性反应肠杆菌科一般为阴性反应假单胞菌一般为阳性假单胞菌一般为阳性硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验待检菌硝酸盐琼脂斜面30s培养物培养物-萘胺1mL对氨基苯磺酸1mL阳性3618-24h阴性亚硝酸盐存在u硝酸盐没有被还原（真阴性反应）硝酸盐没有被还原（真阴性反应）u假阴性结果假阴性结果:硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产物，硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产物，如如NH3、N2、NO或或N2O和和羟胺。羟胺。u需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。u肠杆菌科细菌皆为阳性反应肠杆菌科细菌皆为阳性反应苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物10%三氯化铁三氯化铁4-5滴滴苯丙氨酸琼脂培养基苯丙氨酸琼脂培养基3618-24h苯丙酮酸苯丙酮酸阳性苯丙氨酸脱氨酶苯丙氨酸脱氨酶接种培养物要多避免假阴性立即观察，5min之内变形杆菌阳性，肠杆菌科阴性半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物制成浓菌液制成浓菌液36 5min振摇使酶释放振摇使酶释放阳性生理盐水生理盐水甲苯甲苯1 1滴滴ONPG0.25mlONPG0.25ml37 20min、3h、18h、24huONPG=ONPG=邻硝基酚邻硝基酚-D-D半乳糖苷半乳糖苷u阴性反应不变色阴性反应不变色uONPGONPG为无色为无色upH7.0pH7.0，过酸假阴性，过碱假阳过酸假阴性，过碱假阳性性甘油品红试验甘油品红试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物甘油品红肉汤培养基甘油品红肉汤培养基368d丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛紫红色醌式化合物紫红色醌式化合物品红品红u未接种培养基做对照未接种培养基做对照u复红复红=品红品红u培养时间长培养时间长u用于沙门菌属种间鉴别用于沙门菌属种间鉴别常见沙门菌阴性，乙型副常见沙门菌阴性，乙型副伤寒结果不定伤寒结果不定有机酸盐利用试验有机酸盐利用试验待检菌新鲜营养肉汤培养物待检菌新鲜营养肉汤培养物有机酸盐培养基有机酸盐培养基3614d酸酸沉淀沉淀蓝色蓝色每天观察每天观察酒石酸柠檬酸钠黏液酸溴香草酚兰黄绿色黄绿色白色白色 0.5 0.5mlml醋酸铅饱和水溶液醋酸铅饱和水溶液 u阴性反应一直为蓝色并有大量沉淀u沙门菌对右旋洒石酸盐多为阳性，志贺菌为阴性，培养时间长；沙门菌对左旋洒石酸盐反应不同，其他属为阴性u培养时间长u迟缓反应可分别确定发生期u培养基调中性丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物丙二酸钠培养基丙二酸钠培养基3648h碳酸钠碳酸钠绿色绿色溴香草酚兰蓝色蓝色u先溶酵母膏和盐，调先溶酵母膏和盐，调6.8后，后，再加指示剂再加指示剂u丙二酸钠为唯一碳源丙二酸钠为唯一碳源u黄色为产酸，阴性黄色为产酸，阴性u任何蓝色均判为阳性任何蓝色均判为阳性4、注意事项、注意事项n培养基培养基n对照对照n挑取菌落挑取菌落n纯培养纯培养n严格按照规定进行严格按照规定进行n避免对环境造成污染避免对环境造成污染三、沙门菌噬菌体检验法三、沙门菌噬菌体检验法注意事项：平板涂菌前一定要干燥，以琼脂表面稍平板涂菌前一定要干燥，以琼脂表面稍有皱纹为宜，吸水性好。有皱纹为宜，吸水性好。试验菌液的浓度以肉眼观察，不呈现明试验菌液的浓度以肉眼观察，不呈现明显混浊为宜，不可过浓。显混浊为宜，不可过浓。使用棉签涂布菌液时，勿将琼脂表面划使用棉签涂布菌液时，勿将琼脂表面划破，影响结果。破，影响结果。四四 荧光抗体法荧光抗体法增菌液涂片增菌液涂片加荧光抗体加荧光抗体3730min 95%乙醇浸洗乙醇浸洗1-2minPBSpH9.0冲洗冲洗K氏固定液固定氏固定液固定5-105-10minminPBSpH9.0浸洗浸洗10min蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗PBSpH9.0缓冲甘油封片缓冲甘油封片镜检镜检n专专门门检检测测沙沙门门氏氏菌菌包包括括伤伤寒寒,副副伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌跟跟其其他他乳糖乳糖(+)的菌种的菌种n更更清清楚楚的的区区分分：沙沙门门氏氏菌菌落落粉粉红红色色到到洋洋红红色色；其其他他细菌透明或淡蓝细菌透明或淡蓝n容容易易阅阅读读：透透明明的的背背景景，18-24h培培养养后后有有较较大大的的菌菌落落四 其它方法nELISAnDNA探针nPCR技术检样检样25g+增菌液增菌液挑取可疑菌落挑取可疑菌落3-5个个EMB或或MaccTSI、动力动力TSI底层底层+、斜面、斜面-、H2S-、不产气、无动力不产气、无动力血清学分型血清学分型进一步生化试验进一步生化试验非左非左非志贺菌非志贺菌生化分群生化分群葡萄糖胺试验、葡萄糖胺试验、柠檬酸盐、柠檬酸盐、LYS-、尿素、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷、水杨苷、七叶苷志贺菌分群分型结果志贺菌分群分型结果非志贺菌非志贺菌HE或或SS阳性结果阳性结果志志贺贺氏氏菌菌检检验验程程序序