微生物基本试验原理及操作.pptx

微生物基本试验原理及操作 微生物基本试验l碳源和氮源利用试验l碳水化合物的代谢试验l各种酶类试验l氨基酸和蛋白质代谢试验碳源和氮源利用试验 l柠檬酸盐试验l葡萄糖酸盐试验柠檬酸盐试验 l原理：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解柠檬酸钠生成碳酸钠，使培养基呈碱性。能利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌，也能利用铵盐作为唯一氮源，铵盐被分解为氨而产生碱性。西蒙氏柠檬酸盐培养基成分lMgSO4-7H2O0.2glNH4H2PO41glK2HPO41gl柠檬酸钠5gl氯化钠5gl琼脂20gl0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mll蒸馏水1000ml结果：阳性者表面上长有菌落，培养基变为蓝色。葡萄糖酸盐试验 l原理：检查细菌是否具有氧化葡萄糖作为唯一碳源，并具有还原2-酮基葡萄糖酸盐与班氏试剂混合加热生成黄红色酮类的能力。l方法：接种大量待检菌于培养基内，35，24-48小时，0.5ml培养基加班氏试剂3滴左右，加热煮沸后观察结果。葡萄糖酸盐蛋白胨肉汤成分 l蛋白胨0.15gl酵母浸膏0.1gl磷酸二氢钾0.1gl葡萄糖酸钾（或钠）4gl蒸馏水100mll结果：出现黄色到橙红色沉淀为阳性，无颜色变化为阴性。碳水化合物的代谢试验 l氧化-发酵试验（OF试验）l糖醇发酵试验lB半乳糖苷酶试验（ONPG试验）l甲基红试验lVP试验l胆汁七叶苷试验氧化-发酵试验（OF试验）l原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的称为氧化型；在无氧条件下降解葡萄糖的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可以区别细菌的代谢类型。Hugh-Leifson二氏培养基（O-F培养基）成分l蛋白胨2gl磷酸氢2钾0.3克l氯化钠5gl葡萄糖10gl0.2%溴麝香酚蓝溶液12mll琼脂2.5gl蒸馏水1000mll方法：将待检菌接种于二支Hugh-Leifson培养基的试管中，均用接种针穿至管底，其中五支加入灭菌的液体石蜡约1厘米厚。35，培养48小时观察结果。培养基颜色变黄即为产酸。结果l代谢类型加蜡封口管开放管l发酵型产酸产酸l氧化型不变色产酸l产碱型不变色不变色l糖醇发酵试验 l原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇类的酶，所以分解糖、醇类的能力各不相同。分解糖、醇类后产生的代谢产物可因菌种不同而异，有的产酸、产气，有的仅产酸，故用于鉴别细菌。糖、醇类试验培养基成分 l蛋白胨水或肉膏汤100mll所需的糖、醇或苷类0.5或1gl1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml结果 l接种的细菌，若能耐分解培养基中的糖类产酸时，则使培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒管内出现气泡。若不分解则无变化。B半乳糖苷酶试验（ONPG试验）l原理：有的细菌可产生B-半乳糖苷酶，此酶可分解邻-硝基酚-B-D-半乳糖苷（ONPG）。ONPG为无色，经B-半乳糖苷酶水解后，可产生黄色的邻硝基酚，即使浓度很低也能检出。结果 l呈现黄色为阳性反应。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，本试验可作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。甲基红试验 l原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而使培养基的pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。甲基红试验 l原理：有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醛、气体和水），则培养基的酸碱度仍在6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）。葡萄糖蛋白胨水培养基成分l多价蛋白胨7gl葡萄糖5gl磷酸氢二钾5gl蒸馏水1000ml方法：被检菌接种于上述培养基内，于35培养48小时，于2ml培养液内加甲基红指示剂2滴，立即观察结果。l结果：红色为阳性；桔红色为弱阳性；黄色为阴性。VP试验 l原理：有些细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气的氧氧化为二乙酰（丁二酮），进而与培养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。培养基中的胍基太少时，加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酸酐等，可加速此反应。试剂：甲液：6%a-萘酚乙醇溶液乙液：40%氢氧化钾溶液l方法：将被检菌接种葡萄糖蛋白胨水培养基后，于35培养48小时，于2ml培养基内加入甲液1ml和乙液0.4ml，振摇后观察结果。l结果：于数分钟内呈红色为阳性；如无红色出现，而且于35中4小时后仍如故者即为阴性。本试验较为敏感。胆汁七叶苷试验l原理：在10-14%胆汁存在下，测定细菌水解葡萄糖苷七叶苷为七叶亭和葡萄糖的能力。胆汁七叶苷培养基成分 l蛋白胨5gl牛肉浸膏3gl牛胆汁（胆汁）40gl七叶苷1gl柠檬酸铁0.5gl琼脂15gl蒸馏水1000mll结果：培养基变为黑色或深褐色为阳性。有生长物时，并不表示七叶苷裂解，仅表示胆汁浓度不能抑制D群链球菌外的细菌生长。各种酶类试验l过氧化氢酶（触酶）试验l氧化酶试验l血浆凝固酶试验l硝酸盐还原试验l胆汁溶解试验l环腺苷酸（cAMP）试验过氧化氢酶（触酶）试验 l原理：有些细菌具有过氧化氢酶，能将过氧化氢酶分解为水。l试剂：3%过氧化氢溶液。l方法：玻片法：用牙签挑取1824小时培养的菌苔，置于洁净的玻片上，滴加3%过氧化氢溶液12滴。试管法：取不含血液的1824小时培养物一接种环于试管内，加入1ml3%过氧化氢溶液。3%过氧化氢溶液应置于棕色瓶内冷藏。l结果：产生大量气泡为阳性，不产生气泡为阴性。血浆凝固酶试验 l原理：凝固酶能凝固血浆纤维蛋白，是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。本试验分玻片法和试管法，玻片法主要是检测结合凝固酶，试管法是为了肯定玻片法试验结果和对玻片法试验阴性者进行复查，检测游离凝固酶。血浆凝固酶试验l原理：结合凝固酶为金黄色葡萄球菌细胞表面含有，游离凝固酶为金黄色葡萄球菌产生的一种胞外酶，两酶均可作用于血浆中的纤维蛋白原，使其转变为纤维蛋白，形成凝块。方法：l玻片法：在玻片上加一滴灭菌生理盐水，取葡萄球菌18-24小时肉汤培养物一环，或挑取平板上一个单个菌落制成浓菌悬液，再加一接种环新鲜人或兔血浆与菌悬液混匀。同时做阳性菌和阴性菌对照试验，立刻观察凝块的形成。本试验应先在生理盐水中乳化，检查有否自凝现象。防止出现假阳性结果。阳性结果一般在5-20秒内出现，若3-4分钟后仍无凝固，可考虑为玻片法试验阴性。l试管法：将洁净小试管中加0.5ml未稀释的人或兔血浆，加0.5ml培养18-24小时的葡萄球菌肉汤培养物一满环，或挑取平板上的纯菌落，轻轻转动（不要摇动）试管混匀。放35水浴中4小时，每隔30分钟检查一次有无凝固。检查时不要振动或摇动试管，可轻轻将试管倾斜以观察有无凝块。大多数金黄色葡萄球株在354小时可以凝固血浆，如果阴性对照。枸椽酸盐抗凝的血浆可产生假阳性结果。氧化酶试验 原理：某些细菌具有氧化酶，在有氧和细胞色素C时，使还原型细胞色素C氧化，氧化型细胞色素C再使二甲基对苯二胺氧化，产生玫瑰红至暗紫色。有时菌落本身带有红色，不易观察，可再加入a-萘酚乙醇溶液，使生成深蓝色的靛酚蓝。l试剂：l11%盐酸二甲基对苯二胺（或四甲对苯二胺）水溶液l21%a-萘酚95%乙醇溶液l方法：取18-28小时的新鲜培养物，用无菌滤纸条，蘸取菌落少许，滴加1%盐酸二甲基对苯二胺1-2滴，观察结果。l结果：一分钟内出现紫红色为阳性。若菌落本身有色素，则再滴加a-奈酚1-2滴，出现蓝色则为阳性。硝酸盐还原试验 l原理：硝酸盐还原反应有两个过程，其一是硝酸盐还原为亚硝酸盐，其二是继续将亚硝酸盐进一步分解为氨、氮、氧化氮等气体终末产物。硝酸盐还原试验培养基成分 l蛋白胨1gl硝酸钾0.1gl蒸馏水100mll方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基中，35培养1-4天，将甲、乙试剂各加0.1ml于试管内，混匀观察结果l结果：出现红色为阳性。如无红色出现，应加少量锌粉，如仍无红色说明亚硝酸盐进一步分解成氮、氨等气体，应判为阳性；如加锌粉出现红色，说明还原剂锌粉使硝酸盐还原为亚硝酸盐，待检菌无还原硝酸盐的能力，为阴性。胆汁溶解试验l原理：在特定时间和温度条件下测定胆盐溶解细菌的能力。溶菌的机理尚未定论，有人认为胆盐或胆汁能激活肺炎链球菌的自溶酶，使菌体发生溶解。l试剂：10%去氧胆酸钠溶液或牛胆汁l平板法：10%去氧胆酸钠溶液一接种环，加于血琼脂平板的试验菌落上，置于35孵育30分钟，肺炎链球菌菌落消失为阳性。阴性者菌落仍存在。环腺苷酸（cAMP）试验 l原理：B群链球菌（无乳链球菌）能产生一种因子（cAMP因子），这种因子在绵羊血或牛血培养基上与金黄色葡萄球菌-溶血素起协同作用，促进-溶血素的活性。因此在两种细菌的交界处溶血力增加，出现箭头形溶血区。l方法：首先在羊血平板上接种一长条金黄色葡萄球菌（药敏质控菌）再将被检菌与金黄色葡萄球菌接种线垂直接种一短条，两者不能相交，应相距3mm左右，同时在被检菌接种线对侧，用同样方法接种阴性和对照菌，35培养过夜，如放在CO2烛缸内结果更为好看（金黄色葡萄球菌用ATCC25923为佳）。l结果：在被检菌接种线与金黄色葡萄球菌接种线处出现一个矢状加强溶血区，为CAMP阳性。阴性无加强溶血区。氨基酸和蛋白质代谢试验l吲哚试验l硫化氢试验l苯丙氨酸脱氨酶试验l氨基酸脱羧酶试验（赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸）l脲酶试验l明胶液化试验吲哚试验l原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。蛋白胨水培养基成分l蛋白胨（或胰胨）10-20gl氯化钠5gl蒸馏水1000mlkovac氏试剂l对二甲氨基苯甲醛10gl纯戊醇150mll纯浓盐酸50mll先将试剂溶于醇中，缓慢加入盐酸即成。l方法：挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基，于35培养1-2天，沿管壁徐 徐 加 入 kovac氏 试 剂0.5ml，使成两层，观察结果。l结果：在两者液面交界处出现红色为阳性，无色为阴性。硫化氢试验l原理：细菌分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）和含硫化物生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子生成黑色的硫化物。由此间接地检测细菌是否产生硫化氢。l培养基：三糖铁培养基或克氏双糖铁培养基l结果：培养基黑为阳性，无变化为阴性。苯丙氨酸脱氨酶试验 l原理：细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，能使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，苯丙酮酸与铁离子作用生成绿色络合物。苯丙氨酸培养基成分 lDL苯丙氨酸 0.2g（L苯丙氨酸0.1g）l酵母浸膏0.3gl氯化钠0.5gl磷酸氢二钠0.1gl琼脂1.2gl蒸馏水100mll试剂：10%三氯化铁溶液：将10克三氯化铁溶于100ml蒸馏水中即成。l方法：将待检菌接种于培养基斜面上，35培养24小时，滴加三氯化铁试剂，观察结果。l结果：培养基斜面上显绿色为阳性，不变色为阴性。氨基酸脱羧酶试验（赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸）l原理：检查细菌使氨基酸脱去羧基，生成胺类化合物，使培养基变碱的能力。氨基酸脱羧酶基础培养基成分 l蛋白胨5gl酵母浸膏3gl葡萄糖1gl6%溴甲酚紫洒精溶液1mll蒸馏水1000mll将上述成分溶于蒸馏水，然后加进所需氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸、精氨酸），使其浓度为.。对照管不加氨基酸。l方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封灭菌液体石蜡，35培养24小时以上观察结果。注意事项l培养基pH应偏酸，有利于酶的形成。l加封液体石蜡造成厌氧环境，在厌氧环境下氨基酸脱羧生成的胺才稳定，另外也可避免出现假阳性。l如对照管不变色则不能判断结果。l结果：接种待检菌的测定的培养基是紫色，对照管是黄色为阳性；两管均是黄色为阴性。脲酶试验l原理：某些细菌能产生脲酶。脲酶可分解尿素，尿素经分解后产生大量的氨，使培养基变碱。尿素培养基成分 l蛋白胨1gl氯化钠5gl葡萄糖1glKH2PO42gl20%尿素水溶液100mll琼脂15gl0.1%酚红水溶液12mll蒸馏水900mll方法：将被检菌接种于尿素培养基后，置35培养18-24小时观察结果。阴性应观察4天。l结果：细菌分解尿素后培养基变红为阳性，不变为阴性。明胶液化试验l原理：明胶酶是细菌产生的一种胞外酶，能分解明胶为氨基酸，从而失去凝固力，使半固体的明胶培养基成为液体。明胶培养基制法 l于普通琼脂中加入1%明胶即成。l方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20培养7天，逐日观察明胶液化现象。l如室温高培养基自行溶化时，可于冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果。另取一支未接种细菌的培养基为对照管。l结果：明胶培养基倒置有液化为阳性，仍凝固者为阴性。l快速明胶液化试验取培养18-24小时斜面或平板菌苔，用0.5-1ml无菌生理盐水制成浓菌悬液,放入一条未显影的X线胶片（已曝光胶片对此试验无影响），置37水箱。于1、4和24小时观察结果，浸入液体一端胶片的蓝灰色明胶层脱落成透明者为阳性，阳性菌株大都在1-4小时内液化，24小时仍未脱落为明胶酶阴性。再见！