细菌实验诊断技术.pptx

第六章 细菌实验诊断技术与质量控制 细菌感染的细菌感染的检验：检验：是指样品的采集送检、处理，运用表型和遗传学方法检查病原体的特征作出结果报告的全过程。1.保持检验过程的阶段性、快速性和连续性保持检验过程的阶段性、快速性和连续性显微镜检查、分离培养、血清学实验、生化和分子生物学试验、药敏实验等。如能初步鉴定，可分别先后及时向临床提供信息。第一节第一节细菌感染的检验原则细菌感染的检验原则2.2.根据诊断目的决定鉴定的水平根据诊断目的决定鉴定的水平 （1 1）病原学诊断）病原学诊断鉴定到细菌的种；鉴定到细菌的种；（2 2）指导临床治疗）指导临床治疗进行直接或间接药物敏感实验进行直接或间接药物敏感实验 （3 3）流行病学监控和调查）流行病学监控和调查鉴定到型鉴定到型 （4 4）病原学研究、疗效监控）病原学研究、疗效监控分子水平的检测分子水平的检测3.3.了解检验对象的背景了解检验对象的背景 （1 1）病人的背景）病人的背景 （2 2）标本的来源）标本的来源1 1）尽早采集尽早采集尽早采集尽早采集 一旦怀疑细菌感染，应及时采集标本进行细菌学检验，一旦怀疑细菌感染，应及时采集标本进行细菌学检验，尽早获得病原学诊断和抗生素敏感资料，对细菌感染的治疗具有极其重要尽早获得病原学诊断和抗生素敏感资料，对细菌感染的治疗具有极其重要意义；意义；22）标本采集尽量在）标本采集尽量在用药前进行用药前进行用药前进行用药前进行；33）根据可疑病原菌和实验方法的不同）根据可疑病原菌和实验方法的不同选择合适的采集时期选择合适的采集时期选择合适的采集时期选择合适的采集时期；【例如】例如】肠伤寒病程第肠伤寒病程第1 1周采血培养阳性率最高，周采血培养阳性率最高，第2周开始下降；骨髓培养阳性率的趋势和血培养一致但始终高于血培养，且持续至第五周阳性率仍达52%；粪便培养阳性率在第24周最高。4.重视样品的采集和送检重视样品的采集和送检4 4）注意注意无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作，尽量避免杂菌污染，尽量避免杂菌污染；5 5）注意采集的注意采集的方法和部位方法和部位方法和部位方法和部位；6 6）标本必须新鲜，）标本必须新鲜，及时运送；及时运送；及时运送；及时运送；7 7）标本的保存、处理要严格。）标本的保存、处理要严格。5.必须用纯培养物鉴定必须用纯培养物鉴定选用选用单个菌落单个菌落1 1）选择有价值的试验）选择有价值的试验）选择有价值的试验）选择有价值的试验：所选项目大结果可能为阴性所选项目大结果可能为阴性/阳性，但阳性阳性，但阳性/阴性率应大于阴性率应大于90%90%，否则无意义。，否则无意义。2 2）选择快速简便的项目）选择快速简便的项目）选择快速简便的项目）选择快速简便的项目：鞭毛染色、氧化酶、凝固鞭毛染色、氧化酶、凝固酶、触酶、酶、触酶、O/FO/F等应做为首选项目。等应做为首选项目。3 3）一种试验有多种方法时，应了解不同试验的敏）一种试验有多种方法时，应了解不同试验的敏）一种试验有多种方法时，应了解不同试验的敏）一种试验有多种方法时，应了解不同试验的敏感性和特异性。感性和特异性。感性和特异性。感性和特异性。6.鉴定实验的选择鉴定实验的选择第二节第二节细菌感染的检验细菌感染的检验程序和方法程序和方法临床标本预处理增 菌接种培养基，分离单个菌落各种鉴定试验涂片染色快速诊断试验生化试验血清学实验涂片染色药敏试验动物试验初步诊断报告最终诊断报告一、一般检验程序一、一般检验程序2.2.染色标本染色染色标本染色 1 1）单染色法）单染色法 2 2）鉴别染色法（复染色法）鉴别染色法（复染色法 ）：）：革兰染色（革兰染色（Gram stainGram stain，GSGS）二、形态学检查二、形态学检查涂片染色涂片染色 1.1.不染色标本检查不染色标本检查 悬滴或压迹法，观察活细菌轮廓、动力等。悬滴或压迹法，观察活细菌轮廓、动力等。结晶紫1min卢戈碘 1min95%乙醇30s稀释复红 30s 血液、分泌物、排泄物、穿刺液、脑脊液等标本和液体培养物可直接涂片镜检，有些细菌可做出初步诊断。病病种种标标本本方方法法结结果果鼠鼠疫疫痰，腺穿刺液痰，腺穿刺液GSGS，亚甲兰染色亚甲兰染色G-两极弄染，多形态两极弄染，多形态霍霍乱乱水样便水样便GSGS，制动试验制动试验G-弧菌，流星样运动弧菌，流星样运动炭炭疽疽痰，渗出物痰，渗出物GSGS，亚甲兰染色亚甲兰染色/串珠试验串珠试验G+大大杆菌杆菌，竹节状排列，有芽，竹节状排列，有芽胞和荚膜胞和荚膜白白喉喉假膜，咽拭子假膜，咽拭子GSGS，亚甲兰染色亚甲兰染色G+棒状，异染颗粒棒状，异染颗粒/特殊排列特殊排列淋淋病病尿道尿道/阴道分泌物阴道分泌物GSGSG-双球菌，位于脓细胞内双球菌，位于脓细胞内/外外流流脑脑脑脊液、瘀血癍脑脊液、瘀血癍GSGSG-双球菌，位于脓细胞内双球菌，位于脓细胞内/外外肺结核肺结核痰痰抗酸染色抗酸染色兰色背景中红色杆菌兰色背景中红色杆菌梅梅毒毒病变渗出液病变渗出液暗视野暗视野白色折光活动的密螺旋体白色折光活动的密螺旋体三、分离培养三、分离培养（一）培养基（一）培养基：1.1.培养基的种类培养基的种类2.2.调整培养基的调整培养基的pHpH；2.培养基的配制培养基的配制1.1.根据组成准确称取，混悬于装有蒸根据组成准确称取，混悬于装有蒸馏水烧瓶中，加热溶解；馏水烧瓶中，加热溶解；3.3.过滤澄清过滤澄清 ；4.4.分装分装 5.5.灭菌灭菌 6.6.质量检查质量检查 7.7.保存保存 （二）接种与分离技术（二）接种与分离技术1.接种工具接种工具1）接种环和接种针 是细菌学实验必需的工具。2）接种罩、无菌工作台、无菌室、生物安全柜 2.2.接种与分离技术接种与分离技术1 1）平板划线分离）平板划线分离：连续划线放射划线分区划线2 2）斜面的接种）斜面的接种：3 3）半固体和液体培养基的接种）半固体和液体培养基的接种：1.1.温度：温度：3737、2222、44、4242（三）培养条件：（三）培养条件：2.2.气体：气体：1 1）普通培养法）普通培养法2 2）COCO2 2培养培养厌氧手套箱烛缸厌氧袋厌氧罐3）厌氧培养厌氧培养COCO2 2培养箱培养箱四、生化试验四、生化试验 1.1.糖（碳水化合物）分解试验糖（碳水化合物）分解试验2.2.氧化一发酵试验（氧化一发酵试验（O/FO/F试验）试验）【原理】又称HughLeifson（HL）试验。细菌在分解葡萄糖的过程中，必须以分子氧作为电子受体的，称为氧化型（氧化型（O O）；可以进行无氧降解的，称为发酵型（发酵型（F F），此类细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖；不分解葡萄糖的，称为产硷型（产硷型（-）。利用此试验可区分细菌的代谢类型。F型型O型型型型3.甲基红（甲基红（MR）试验和）试验和VP试验试验【原理】甲基红红色红色乙酰甲基甲醇加入碱，被空气中的氧氧化为丁二酮培养基pH在6.2以上加入甲基红呈黄色黄色VP试验试验【培养基】葡萄糖蛋白胨水培养基。葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸等培养基的pH下降至4.5以下与培养基中精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物-奈酚加速反应奈酚加速反应转化为其它物质MR试验试验【原理】氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。【方法】取滤纸一角，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即粉红色，并于5-10秒内呈现深紫色。4.4.氧化酶试验氧化酶试验【原理】过氧化氢酶可使过氧化氢分解为分子态氧。【方法】滴加3%过氧化氢溶液数滴于玻片上，挑取固体培养基上的菌落少许于过氧化氢溶液，观察结果。【结果】30s内产生大量气泡者为阳性。5.5.过氧化氢酶（触酶）试验过氧化氢酶（触酶）试验【原理】某些细菌能产生尿素酶分解尿素，产氨使培养基变碱。【方法】将被检菌接种尿素培养基35培养1824h观察结果。阴性时应继续观察4d。【结果】酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性 6.6.尿素酶尿素酶试验试验【原理】细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。【方法】挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基，于35培养12d，沿管壁徐徐加入吲哚试剂少许，使成两层，观察结果。【结果】两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。7.7.吲哚试验吲哚试验 【原理】当细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸钠，使培养基变碱。【方法】在枸橼酸盐琼脂斜面上浓密划线，接种被检菌，于35培养14d，逐日观察结果。【结果】枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，培养基变蓝为阳性；无细菌生长、颜色不变（绿色）为阴性。8.8.枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验五、免疫学试验五、免疫学试验 人体受致病菌感染，免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特人体受致病菌感染，免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体。抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价（滴度）异性抗体。抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价（滴度）的升高。因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中的升高。因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的有无相应特异抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验，故称为辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验，故称为血清学诊断血清学诊断。血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的抗体效价比前者后者的抗体效价比前者升高大于等于升高大于等于4倍倍时方有意义。时方有意义。常用方法：直接凝集试验、乳胶常用方法：直接凝集试验、乳胶凝集试验、沉淀试验、补体结凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、中和试验、合试验、中和试验、ELISA。（一）血清学诊断（一）血清学诊断(serologicaldiagnosis)以细菌的菌体成分为待测抗原，用特异性的抗体进行检测，以细菌的菌体成分为待测抗原，用特异性的抗体进行检测，用于细菌的分型或鉴定用于细菌的分型或鉴定常用方法：常用方法：1.凝集试验凝集试验2.荚膜肿胀试验荚膜肿胀试验3.免疫荧光技术免疫荧光技术（二）免疫学鉴定（二）免疫学鉴定六、药物敏感试验六、药物敏感试验 七、分子生物学试验七、分子生物学试验1.核酸杂交2.核酸扩增技术（PCR、RFLP、SSCP等）3.基因芯片、蛋白质芯片八、八、微生物商品化及自动化检测和鉴定系统微生物商品化及自动化检测和鉴定系统 API数码鉴定系统VITECK全自动细菌鉴定系统血标本培养系统第三节实验室质量控制l一、室内质量控制是由实验室内部制定并实施的，是质量保证的核心和基础l二、室间质量控制评价是由实验室外部的组织或机构对实验室进行的质量评价一、室内质量控制l人员与组织管理l标准操作程序手册l培养基的质量控制l试剂、染色液和诊断血清的质量控制l体外抗菌药物敏感试验的质量控制l常用仪器的质量控制l室内全面质量控制l标准菌株的来源和保存二、室间质量控制评价 l室间质量控制的一般性检查项目l熟练程度的考核l盲点试验l质控结果的分析与评价