细胞计数原理.pptx

微生物细胞计数及染色操作微生物细胞计数及染色操作 一、目的要求一、目的要求学会血球计数板的使用方法了解革兰氏染色的原理了解革兰氏染色的原理学习并掌握革兰氏染色的方法学习并掌握革兰氏染色的方法二二 酵母细胞计数原理酵母细胞计数原理 微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。算后，即可得出实际数值。细菌染色基本原理细菌染色基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是它是1884年由丹麦医师年由丹麦医师Gram创立的。创立的。革兰氏染色法（革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用细菌，用G-表示。表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。胞壁的成分和结构不同而造成的。肽聚糖肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌肽聚糖革兰阳性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥青霉素作用点溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革兰阴性菌肽聚糖革兰阴性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链聚糖骨架、四肽侧链肽聚糖肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌细胞壁特殊组分革兰阳性菌细胞壁特殊组分壁磷壁酸膜磷壁酸革兰阴性菌细胞壁特殊组分革兰阴性菌细胞壁特殊组分革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较细胞壁细胞壁 革兰阳性菌革兰阳性菌革兰阴性菌革兰阴性菌强度强度较坚韧较坚韧较疏松较疏松厚度厚度20-80nm10-15nm肽聚糖层数肽聚糖层数可多达可多达50层层1-2层层肽聚糖含量肽聚糖含量占细胞壁干重占细胞壁干重50%-80%占细胞壁干重占细胞壁干重5%-20%磷壁酸磷壁酸+外膜外膜+脂蛋白脂蛋白+脂多糖脂多糖+革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（）和复染液（counterstain）。）。碱性染料初染液碱性染料初染液结晶紫（结晶紫（crystal violet）媒染剂媒染剂碘（碘（iodine）脱色剂脱色剂95的酒精（的酒精（ethanol）复染液复染液番红番红三、实验器材三、实验器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。乙醇，载玻片，显微镜等。显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数计数 板、载玻片等。板、载玻片等。麦芽汁培养基、酵母菌。麦芽汁培养基、酵母菌。吸管、吸水纸等。吸管、吸水纸等。四、实验步骤四、实验步骤1涂片：将培养涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未小时的大肠杆菌和未知菌，培养知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球小时的枯草芽孢杆球菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。手为宜。（一）（一）染色实验染色实验2染色染色（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。水洗。（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。分钟，水洗。（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即秒钟，立即用水冲净酒精。用水冲净酒精。（4）复染：用番红液染）复染：用番红液染12分钟，水洗。分钟，水洗。（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。大肠杆菌革兰氏染色炭疽芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌(二二)酵母细胞数的测定操作方法酵母细胞数的测定操作方法1.血球计数板的构造血球计数板的构造 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度为，深度为，其体积为其体积为0.1mm3。计计数数室室通通常常有有两两种种规规格格。一一种种是是大大方方格格内内分分为为16中中格格，每每一一中中格格又又分分为为25小小格格；另另一一种种是是大大方方格格内内分分为为25中中格格，每每一一中中格格又又分分为为16小小格格。但但是是不不管管计计数数室室是是哪哪一一种种构构造造；它它们们都都有有一一个个共共同同的的特特点点，即即每每一一大大方方格格都都是由是由1625=2516=400个小方格组成，见图个小方格组成，见图。2.血球计数板的使用血球计数板的使用(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即倍即可。可。(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。(5)计数时，如果使用16格25格规格的计数室，要按对角线位取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。4.血球计数板的清洁血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用干，或用95的乙醇、无水乙醇、丙酮等有的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。则必须重复清洗直到干净为止。1结果结果列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌的染色反应，并判断它们分别是的染色反应，并判断它们分别是G-或或G+.2思考题思考题（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？其染色成败的关键一步是什么？（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？可靠？五、实验报告五、实验报告