牛源制品病毒安全性检测.pptx

2004年03月军事医学科学院输血医学研究所问题的提出：疯牛病与新克-雅氏病艾滋病“生物灾害”2004年03月军事医学科学院输血医学研究所牛源制品主要是指来源于牛的、与医药有关的药品或生物材料生物技术与药用材料：血清、胶原、牛黄生化制品：胸腺肽、小牛血去蛋白提取物 血浆蛋白：纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、因子血红蛋白：血液代用品转基因蛋白：人白蛋白、人乳铁蛋白2004年03月军事医学科学院输血医学研究所感染性疾病与关注对象欧盟对牛血清的要求相关的DNA病毒相关的RNA病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所细菌性疾病：结核杆菌病、布鲁氏杆菌病、沙门氏菌病、炭疽病毒性疾病：口蹄疫、传染性海绵样脑病、白血病、假性牛痘.寄生虫性疾病：日本分体吸虫病、弓形体病牛的感染性疾病2004年03月军事医学科学院输血医学研究所消除牛源病原体技术2004年03月军事医学科学院输血医学研究所值得关注的对象潜在性感染的病毒：（1）隐性感染而不引起任何疾病的病毒；（2）某些持续性感染的病毒；（3）处于潜伏状态的病毒。由于机体生理状态（如怀孕）、外界环境的变化，机体抵抗力下降等因素，这类病毒可能大量增殖或引起疾病的发生。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所关注的对象内源性病毒：内源性反转录病毒（ERV）是指以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中，并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。朊病毒：朊病毒是亚病毒中的重要感染因子，侵害动物与人类。因其主要由蛋白质构成，迄今尚无含有核酸的确切证据，故暂定名为朊病毒(Virino)或蛋白侵染子(Prion)。由于对各种朊病毒的本质的了解不够，采用“因子”命名，例如痒疫因子和牛海绵状脑病因子等，似乎较为恰当。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所病毒危害性与检测技术应该考虑生物安全性的病毒集中在两个方面：人兽共患病病毒与致癌、免疫抑制或严重退行疾病有关的病毒检测技术细胞培养：至少2种细胞，其中1种为牛源细胞抗体检测：BVDV抗体为必检核酸检测：PCR、RT-PCR2004年03月军事医学科学院输血医学研究所三 牛源制品的病毒安全性脊椎动物病毒的形态DNA病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所脊椎动物病毒的形态RNA病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所2004年03月军事医学科学院输血医学研究所2004年03月军事医学科学院输血医学研究所2004年03月军事医学科学院输血医学研究所2004年03月军事医学科学院输血医学研究所2004年03月军事医学科学院输血医学研究所2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛乳头状瘤病毒牛乳头状瘤病毒（bovine papillomaviruses,BPV）分类地位：乳多空病毒科，乳头状瘤病毒属形态特征：无囊膜，55nm理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗A model of the papillomavirus capsid 2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛乳头状瘤病毒根据交叉杂交试验，可以感染牛的乳瘤病毒分为6个主要亚群，每一种病毒在牛的皮肤产生特定的病变。某些亚群可以转化人细胞，这些病毒与牛的消化道、生殖道和眼部肿瘤等的发展有关。不能用细胞感染检测，可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛多型瘤病毒牛多型瘤病毒（bovine polyomaviruses,BPyV）分类地位：乳多空病毒科，多型瘤病毒属形态特征：无囊膜，45nm理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗PCR检测，BPyV在胎牛血清中的污染批次达70，可从某些批次的血清中分离到病毒。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛多型瘤病毒BPyV倍受关注，它可能是一种人兽共患病，饲养人员、兽医的体内有较高水平的抗体，而对大多数人群则缺乏抵抗力。可以感染灵长类细胞，包括人的细胞。影响细胞培养的结果。检测：能用细胞感染检测，在猴肾细胞可以产生特异性的病变，即胞浆、胞核空泡化。PCR检测，使用特异性的引物扩增、杂交或测序。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛腺病毒牛腺病毒（Adenoviruses）分类地位：腺病毒科，哺乳动物腺病毒属形态特征：无囊膜，90nm理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗分2个主要亚群，10个血清型。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛腺病毒尚不清楚是否人兽共患，但可以转化人细胞。能用细胞感染检测，1群感染牛胚肾细胞并迅速产生细胞病变，2群感染牛睾丸细胞，有时需要盲传。也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛疱疹病毒牛疱疹病毒（Herpesviruses）：有囊膜，150nm，有4个种。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛疱疹病毒BHV-1:引起牛鼻气管炎，牛源制品应该检测病毒。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。BHV-2:引起牛溃疡性乳头炎，奶制品的污染。BHV-3:引起牛恶性卡他热，具有异源宿主感染性。BHV-5:引起牛脑炎。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛痘病毒牛痘病毒（Poxviruses）：有囊膜，300nm，有2个种病毒必须考虑。假牛痘病毒牛丘疹性口炎病毒Orf virus2004年03月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛痘病毒假牛痘病毒:引起牛乳房和乳头增生性病变、挤奶工皮肤丘疹。牛丘疹性口炎病毒引起牛口腔粘膜、鼻镜、鼻孔上皮溃疡，人的手、臂丘疹。牛源制品应该检测病毒。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒（FMDV）：无囊膜，20nm，人兽共患，最重要。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒（FMDV）：无囊膜，20nm，人兽共患，最重要。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛病毒性腹泻病毒牛腹泻病毒（BVDV）：有囊膜，70nm，牛群中普遍存在，倍受关注。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛轮状病毒牛轮状病毒：无囊膜，80nm，牛群中普遍存在，对人和牛的危害不大。能用细胞感染、ELISA等检测，也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛呼肠孤病毒呼肠孤病毒：无囊膜，80nm，牛群中普遍存在，对人和牛的危害不大。能用细胞感染、ELISA等检测，也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛反转录病毒与生物安全性相关的牛反转录病毒有两种牛白血病病毒（BLV）牛免疫缺陷病病毒（BIV）2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛白血病病毒牛白血病病毒（BLV）：有囊膜，100nm，牛群中普遍存在。未发现对人的感染性，可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛免疫缺陷病病毒牛免疫缺陷病病毒（BIV）：有囊膜，120nm，国内牛群阳性率2.32，对人和牛的危害不大。用蛋白印迹法检测，也可用PCR检测。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒朊病毒引起的人和动物的疾病多种动物和人的亚急性海绵样脑病与羊痒疫因子有关人的库鲁病(Kuru)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、阿耳茨海默病(Alzheimerdisease)、格-史氏综合征(Gerstmann-Strausslersyndrome)羊的痒疫(Scrapie)，水貂传染性脑病(Transmissibleminkencephalopathy)，黑尾鹿和糜鹿的慢性消耗病(Chronicwastingdiseaseofmuledeerandelk)，牛海绵状脑病(Bovinespongiformencephalpopathy)以及某些公园动物的相关感染症。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒朊病毒引起的人和动物的疾病2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒朊病毒引起的人和动物的疾病2004年03月军事医学科学院输血医学研究所五 朊病毒朊病毒引起的人和动物的疾病2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒 Prusiner1982:theplaqueproteinistheinfectiousagentPrusiner1982:theplaqueproteinistheinfectiousagent(prion)(prion)Thenormal,Thenormal,non-infectiousProteinnon-infectiousProtein(PrP(PrPC C)isencodedbythe)isencodedbythehostandismainlyexpressedonlymphocytesandneuronshostandismainlyexpressedonlymphocytesandneurons TheTheinfectiousprionproteininfectiousprionprotein(PrP(PrPScSc)hasthesameaminoacid)hasthesameaminoacidcomposition,butisresistanttoproteasesandtendstocomposition,butisresistanttoproteasesandtendstopolymerizepolymerize2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所normal cellnormal cellinfected cellinfected cellPrPPrPC Cprn-p prn-p genegenem-RNAm-RNAnormal proteinnormal proteinm-RNAm-RNAinfectious infectious proteinproteinPrPPrPScScprn-p prn-p genegeneEndosomesEndosomesPlaquePlaqueThe Prion Hypothesis朊病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所veryveryslowslowrapidrapidrapidrapidPrPCPrPScPrPCPrPScSeedingmodel(nucleatedcrystallization)Refoldingmodel(templatedirected)朊病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所构象依赖性免疫测定方法（conformation-dependent immunoassay,CDI）能检出微量的prion蛋白，5 h即可出结果。可检测出8株prion，其中包括分别导致绵羊痒病、鹿的慢性消耗性疾病和疯牛病的各株prion。可用于检测活动物。对西班牙、德国和英国的11000头屠宰牛检测结果完全与现在应用的方法相符，而且在实验室和田间试验中，还没有发现假阴性或假阳性结果。该方法的另一突出优点是自动化，因此可以用于大量动物的筛选。2004年03月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒Western BlottingThistypeofassayoffersarapidalternativetothecurrentbio-assayforthedetectionofPrPSCinspikedprocesssamplesfromavalidationstudyandreliesonthedifferentialsensitivityofPrPSCtoproteaseK.TheclosecorrelationbetweenthelevelofPrPscinasampleandinfectivityinthebio-assayallowsarapidpreliminaryassessmentofthelevelofinfectivityinspikedsamples.SamplesaredigestedwithproteaseK,denaturedandthendiluted(viaserial5-folddilutions)toendpoint(thepointwherenoPrPSCcanbedetected)onaSDSPAGEgel.2004年03月军事医学科学院输血医学研究所Positive Control Dilution to End-PointPositive Control Dilution to End-Point朊病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作血液生物制品与病毒安全检测研究室：应用发展研究为主，应用基础研究为辅；以血液制品及病毒安全性为主线，适当拓展研究领域；积极寻求合作，发挥集成优势。下设课题组/方向：血浆蛋白的分离纯化工艺、特性鉴定、药理药效等重组蛋白的研究：原核、酵母、哺乳细胞、转基因动物等抗体制备与应用：单抗、基因重组单抗等配套研究病毒安全检测：国家生物医学分析中心分支血型抗原的相关研究2004年03月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作病毒安全检测实验室挂靠在国家生物医学分析中心，计划2004年申请国家认证。主要工作包括以下几个方面：病毒灭活工艺与检测技术：血浆衍生物、生化制品、相关原材料等异种移植的病毒安全性研究：国家项目为主抗病毒药物的筛选：自选与合作项目为主单克隆抗体的制备与应用：自选与合作项目为主2004年03月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作生物活性材料的病毒安全性检测：血浆衍生物、生化制品、相关原材料等角质蛋白水解物小牛血去蛋白提取物 2004年03月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作异种移植的病毒安全性研究问题的提出异种移植的担忧灵长类动物的病毒感染谱几乎与人类相同：已经放弃作为异种移植的供体。猪为最适供体，病毒感染谱与人类部分交叉：内源性与潜在性病毒，特别是猪内源性反转录病毒可以感染人类的体外培养细胞，引起科学、社会的广泛关注。生物安全无小事2004年03月军事医学科学院输血医学研究所感染性疾病与关注对象欧盟对牛血清的要求相关的DNA病毒相关的RNA病毒2004年03月军事医学科学院输血医学研究所