综合性实验一质粒DNA的小量制备和电泳鉴定.pptx

综合性实验二综合性实验二 质粒质粒DNA小量制备和电泳小量制备和电泳鉴定鉴定一实验目的一实验目的1掌握碱变性裂解法制备质粒掌握碱变性裂解法制备质粒DNA的原理。的原理。2了解质粒了解质粒DNA的性质和用途。的性质和用途。3.掌握掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。4.掌握质粒掌握质粒DNA（闭环和开环构型）的电泳分（闭环和开环构型）的电泳分离鉴定。离鉴定。质粒质粒 plasmid质粒是细菌染色体外的环质粒是细菌染色体外的环形双链形双链DNA分子，能在宿分子，能在宿主细胞内独立自主的进行主细胞内独立自主的进行复制。复制。质粒质粒基因工程中目基因工程中目的基因的运载的基因的运载工具。工具。质粒载体质粒载体大小可从大小可从1kb到到200kb筛选标记筛选标记多克隆位点多克隆位点酶切位点酶切位点复制原点复制原点质粒的特性：质粒的特性：能能独独立立自自主主进进行行复复制。制。细细菌菌内内的的共共生生型型遗遗传因子，能垂直遗传。传因子，能垂直遗传。能能赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一些表型。些表型。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。使没有它们也可以正常存活。质粒的应用质粒的应用质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种达的重要媒介物，这种基因运载工具基因运载工具在基因工程中具有极在基因工程中具有极广泛的应用价值。广泛的应用价值。大多数来自细菌的质大多数来自细菌的质粒是粒是双链双链、共价闭合共价闭合环状环状的分子，以的分子，以超螺超螺旋形式旋形式存在。存在。Visualization of topoisomers.In this experiment,all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling.Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules,they migrate more rapidly during gel electrophoresis.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n琼琼脂脂糖糖是是由由琼琼脂脂分分离离制制备备的的链链状状多多糖糖。其其结结构构单单元元是是D-半半乳乳糖糖和和3.6-脱脱水水-L-半半乳乳糖糖。许许多多琼琼脂脂糖糖链链依依氢氢键键及及其其它它力力的的作作用用使使其其互互相相盘盘绕绕形形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。n因因此此该该凝凝胶胶适适合合于于核核酸酸与与核核蛋蛋白白、免免疫疫复复合合物物的的分分离离、鉴鉴定定及及纯纯化化。在在临临床床生生化化检检验验中中也也常常用于用于LDH、CK等同工酶的检测。等同工酶的检测。影响电泳迁移率的因素：FrictionCharge外加电流、电压分子量 分子形状分子的等电点VoltageCATHODEANODE+-+琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在在一一定定浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶介介质质中中，DNA分分子子的的电电泳泳迁迁移移率与其分子量的常用对数成反比；率与其分子量的常用对数成反比；分分子子构构型型也也对对迁迁移移率率有有影影响响，如如共共价价闭闭环环DNA直线直线DNA开环双链开环双链DNA。当当凝凝胶胶浓浓度度太太高高时时，凝凝胶胶孔孔径径变变小小，环环状状DNA（球球形形）不不能能进进入入胶胶中中，相相对对迁迁移移率率为为0，而而同同等等大大小小的的直直线线DNA（刚刚性性棒棒状状）可可以以按按长长轴轴方方向向前前移移，相相对对迁迁移移率率大大于于0。差速离心差速离心DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION离心离心离心离心:利用离心机转子利用离心机转子利用离心机转子利用离心机转子高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大的离心力，加快液体的离心力，加快液体的离心力，加快液体的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，中颗粒的沉降速度，中颗粒的沉降速度，中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系把样品中不同沉降系把样品中不同沉降系把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质数和浮力密度的物质数和浮力密度的物质数和浮力密度的物质分离开分离开分离开分离开 。二实验原理二实验原理质粒提取原理质粒提取原理质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：1.培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增2.收集裂解细菌收集裂解细菌3.分离纯化质粒分离纯化质粒DNA去除蛋白质去除蛋白质去除去除RNA去除基因组去除基因组DNA苯酚苯酚-氯仿抽提法氯仿抽提法Rnase消化法消化法？质粒质粒DNA和基因组和基因组DNA的区别的区别1.大小不同大小不同2.变性与复性有差异变性与复性有差异质粒质粒DNA较小，通常只较小，通常只有基因组有基因组DNA分子量的分子量的百分之一。百分之一。基因组基因组DNA容易断裂线容易断裂线性化。性化。从从大肠杆菌中分离质粒大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，方法众多，目前目前常用常用的有：的有：依据依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等成及结构等特点选择。特点选择。碱碱变性法既经济且收得率较高变性法既经济且收得率较高,提取的质粒提取的质粒DNA可用于酶切可用于酶切,连接与转化。连接与转化。分离质粒分离质粒DNA和基因组和基因组DNA的方法的方法碱变性法碱变性法煮沸法煮沸法羟基磷灰石层析法等羟基磷灰石层析法等碱裂解法提取质粒的原理碱裂解法提取质粒的原理 应用最为广泛的制备质粒应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。的方法。基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的差的变性与复性的差异而达到分离目的。异而达到分离目的。原理：原理：1.强碱强碱NaOH和和SDS裂解裂解细菌，细菌中的质粒细菌，细菌中的质粒DNA和基和基因组因组DNA在强碱条件下发生变性。在强碱条件下发生变性。2.怎样去除基因组怎样去除基因组DNA？当加入当加入酸酸性物质进行性物质进行中和中和时，质粒时，质粒DNA很快复性，而很快复性，而染色体染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。3.怎样去除蛋白质？怎样去除蛋白质？留有质粒留有质粒DNA的上清，经的上清，经酚酚/氯仿去除蛋白质氯仿去除蛋白质后，用后，用乙乙醇沉淀醇沉淀DNA，即得到质粒，即得到质粒DNA。三、试剂与仪器三、试剂与仪器Biospin质粒质粒DNA小量提取试剂盒：小量提取试剂盒：Resuspension buffer,Lysis buffer,Neutralization buffer,wash buffer,Elution buffer,RNase solution,Spin columns.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，电泳槽，紫外灯电泳仪，电泳槽，紫外灯琼脂糖，琼脂糖，50XTAE电泳缓冲液，电泳缓冲液，6X点样缓冲液，点样缓冲液，DNA Marker，溴化乙啶（荧光染料，结合，溴化乙啶（荧光染料，结合DNA并在紫外线下并在紫外线下显示）显示）四、操作步骤四、操作步骤Resuspension Buffer 细胞悬浮液细胞悬浮液Lysis Buffer 碱裂解液碱裂解液Neutralization Buffer 中和液中和液Spin column 吸附柱吸附柱Wash Buffer 漂洗液漂洗液Elution Buffer 洗脱缓冲液洗脱缓冲液2.质粒质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 1)用胶带将洗净、干用胶带将洗净、干燥的配胶板的边缘封住，燥的配胶板的边缘封住，形成一个胶模并水平放形成一个胶模并水平放置，放入电泳梳。置，放入电泳梳。2)按按水水平平板板的的长长宽宽0.5cm胶胶厚厚，量量取取1TAE，并并按按0.8的的浓浓度度称称取取琼琼脂脂糖糖（agarose），在在微微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。3)等凝胶温度降至大约等凝胶温度降至大约5060以下时，加入以下时，加入1 mg/L溴溴化乙锭（化乙锭（EB）至终浓度为）至终浓度为0.5g/mL；摇匀并轻快地倒；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡。入水平板中，除掉气泡。4)凝固后，将梳子轻轻拔出。凝固后，将梳子轻轻拔出。5)去掉胶带，将水平板放入加有去掉胶带，将水平板放入加有1TAE电泳缓冲液的电电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。6)上样上样Buffer 和和DNA 混匀后点样，记录点样次序。混匀后点样，记录点样次序。7)在水平板两边的点样孔中分别加入在水平板两边的点样孔中分别加入marker即分子量即分子量标记。标记。8)盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（5V/cm）及电泳方向及电泳方向(DNA阴极阳极），开始电泳。阴极阳极），开始电泳。9)当色素接近胶的尾端，停止电泳，样品在紫外灯下当色素接近胶的尾端，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。观察、成像。五、结果五、结果Marker质粒质粒DNA