某些重要学科研究方法.pptx

The key to every biological problem must finally sought in the cell E.B.Wilson,1925 细胞生物学细胞生物学假如你想探索一种化学药物假如你想探索一种化学药物有无抗癌作用有无抗癌作用细胞水平的研究细胞水平的研究1.对恶性肿瘤细胞生长的影响对恶性肿瘤细胞生长的影响（生长曲线）（生长曲线）2.对恶性细胞增殖的影响（分对恶性细胞增殖的影响（分裂指数测定，成集落实验）裂指数测定，成集落实验）3.对恶性肿瘤细胞代谢的影响对恶性肿瘤细胞代谢的影响（DNA，蛋白质合成的影响），蛋白质合成的影响）4.器官培养实验器官培养实验动物水平的研究动物水平的研究1.对致瘤动物的对致瘤动物的治疗作用治疗作用2.动物的肿瘤动物的肿瘤细胞接种实验细胞接种实验分子水平的研究分子水平的研究1.对已知癌基因与抑癌基因的作用对已知癌基因与抑癌基因的作用2.发现未证明的基因或抑癌基因发现未证明的基因或抑癌基因关关 于于 对对 照照1.配对的细胞（配对的细胞（SV3T3-3T3）2.癌细胞与正常或原代培养细胞癌细胞与正常或原代培养细胞3.癌细胞，癌旁组织细胞及正常癌细胞，癌旁组织细胞及正常细胞细胞假如你想研究一种药物假如你想研究一种药物有无致癌作用有无致癌作用 分子生物学分子生物学 1.细胞的转化试验（细胞的选择）细胞的转化试验（细胞的选择）2.动物的致瘤试验（动物的选择）动物的致瘤试验（动物的选择）3.对癌基因，抑癌基因的分析对癌基因，抑癌基因的分析最关心的共同问题最关心的共同问题如何从分子遗传学角度确定疾病的致病如何从分子遗传学角度确定疾病的致病基因或易感基因？基因或易感基因？对一个感兴趣的基因，如何研究其功能对一个感兴趣的基因，如何研究其功能？一般设计原则如何从遗传学角度确定如何从遗传学角度确定疾病的致病基因或易感基因？疾病的致病基因或易感基因？确定被研究群体：获取临床标本确定被研究群体：获取临床标本选择候选基因：从定位区域或文献报道的候选基因中选择选择候选基因：从定位区域或文献报道的候选基因中选择多态性检测：采用测序法确定多态性检测：采用测序法确定SNPSNP或或RFLPRFLP基因分型（基因分型（genotypinggenotyping）：采用高通量方法对每个标本进行基因分型）：采用高通量方法对每个标本进行基因分型单倍型分型（单倍型分型（haplotypinghaplotyping）：采用软件算法（）：采用软件算法（PHASE algorithm PHASE algorithm 或或 DnaSP3.5 algorithmDnaSP3.5 algorithm等）、四配子试验。等）、四配子试验。数据分析：等位基因关联分析数据分析：等位基因关联分析单倍型关联分析单倍型关联分析对一个感兴趣的基因如何研究其功能对一个感兴趣的基因如何研究其功能？生物信息学分析生物信息学分析结构域结构域 序列特点序列特点 亚细胞定位亚细胞定位 相互作用蛋白相互作用蛋白 参与参与pathwaypathway、信号途径信号途径 已知某些功能及作用已知某些功能及作用 （重复序列、（重复序列、pipi位点等、启动子、切接位点）位点等、启动子、切接位点）例：亚细胞定位：荧光蛋白显示、免疫组化：分子相互作用：酵母双杂交、例：亚细胞定位：荧光蛋白显示、免疫组化：分子相互作用：酵母双杂交、pullpulldowndown、CoCoIPIP 机理研究机理研究:细细胞胞分分子子水水平平转染（共转染）实验转染（共转染）实验RNAi反义反义突变实验突变实验阻断剂（抑制物）阻断剂（抑制物）激活剂激活剂体外实验体系体外实验体系动动物物整整体体水水平平转基因动物转基因动物基因敲除动物基因敲除动物疾病模型疾病模型医学分子生物学实验设计中常见的毛病医学分子生物学实验设计中常见的毛病没有对照或不严格的对照，难以判断结果正确与否没有对照或不严格的对照，难以判断结果正确与否实验设计太简单，机理研究不够，影响研究水平实验设计太简单，机理研究不够，影响研究水平文题不符，结论不妥文题不符，结论不妥实例分析目的：在整体水平上证明肝目的：在整体水平上证明肝A A物质参与肝物质参与肝B B物质的合成。物质的合成。方法：大鼠方法：大鼠2020只，分只，分2 2组组 喂喂C C饲料（饲料（C C为为B B前身物）前身物）2 2周后杀死取肝脏周后杀死取肝脏 对照组喂正常饲料对照组喂正常饲料 检测：肝检测：肝D D物质和物质和A A物质物质mRNAmRNA水平，粪水平，粪B B物质含量物质含量 （肝（肝B B物质克分泌至粪中排出）物质克分泌至粪中排出）结果：结果：D D物质和物质和A A物质物质mRNA mRNA 粪粪B B物质合成物质合成结论：结论：A A物质参与了物质参与了B B物质合成物质合成分析：分析：实验设计不合理，因果关系不明确实验设计不合理，因果关系不明确 对照不全对照不全 分组应增加其非前身物分组应增加其非前身物 mRNAmRNA检测中缺内对照检测中缺内对照 建议：建议：A A基因敲除小鼠基因敲除小鼠 离体离体 临床临床A A缺陷病例缺陷病例实例分析实例分析神经科学现代研究方法神经科学现代研究方法一、形态学方法一、形态学方法束路追踪法：束路追踪法：轴浆运输追踪、变性束路追踪、神经元质膜荧光染色轴浆运输追踪、变性束路追踪、神经元质膜荧光染色化学神经解剖法：化学神经解剖法：酶组织化学、免疫组织化学、免疫电子显微镜酶组织化学、免疫组织化学、免疫电子显微镜原位杂交法原位杂交法受体及转运体定位法受体及转运体定位法神经系统功能活动形态定位法：神经系统功能活动形态定位法：脱氧葡萄糖法、脱氧葡萄糖法、Fos法、细胞色素法、细胞色素氧化酶法氧化酶法形态学的观察法（形态学的观察法（Confocal）二、机能学方法二、机能学方法1.神经递质释放量的测定神经递质释放量的测定推挽灌流推挽灌流脑内微透析术脑内微透析术伏安法伏安法脑片脑片突触体突触体抗体微探针抗体微探针2.神经递质的功能测定神经递质的功能测定微电泳微电泳抗体微量注射抗体微量注射3.行为方法行为方法经典条件反射经典条件反射操作式条件反射操作式条件反射三、电生理学方法三、电生理学方法细胞外记录细胞外记录细胞内记录细胞内记录脑内电刺激脑内电刺激电压钳电压钳膜片钳膜片钳脑电波脑电波诱发电位诱发电位四、脑成像方法四、脑成像方法X线脑室造影线脑室造影X线脑血管造影线脑血管造影脑超声脑超声计算机辅助体层摄影（计算机辅助体层摄影（CT）磁共振成像（磁共振成像（MRI）正电子发射体层摄影（正电子发射体层摄影（PET）单光子发射计算机体层摄影（单光子发射计算机体层摄影（SPECT）五、其他五、其他突触体、突触体膜和突触小泡的分离与制备突触体、突触体膜和突触小泡的分离与制备反相反相HPLC受体的放射配体结合分析法受体的放射配体结合分析法RTPCRNorthernWesternSouthern等等等等病理学病理学病理研究的范围和内容病理研究的范围和内容基础科学基础科学 临床医学临床医学疾病病理形态学的演变规律疾病病理形态学的演变规律疾病发病机制疾病发病机制发病机制过程中的形态变化发病机制过程中的形态变化疾病的分子改变疾病的分子改变疾病发病过程中的分子变化疾病发病过程中的分子变化形态学改变和临床表现的关系形态学改变和临床表现的关系病理改变在预后判断中的价值病理改变在预后判断中的价值病理研究设计原则病理研究设计原则科学循证的原则科学循证的原则合理对照的原则合理对照的原则实事求是的原则实事求是的原则符合统计学原则符合统计学原则病理研究设计的要点病理研究设计的要点从临床实践中发现问题、提从临床实践中发现问题、提出问题出问题用适当的科学方法研究问题实事求是总结问题，找出科学规律技术的选择依据问题决定使用的技术以问题为中心，从不同层次应用不同的技术注意细节注意细节病例病例 宁缺勿滥宁缺勿滥材料材料 准确真实准确真实细胞系细胞系 性状，明确无误性状，明确无误组织组织 纯净纯净 激光捕捉激光捕捉 单细胞单细胞 显微切割显微切割 精确定位精确定位