果蝇与其他物种遗传标记比较分析.pptx

（1）D.Virilis-10只只 （2）黑腹果蝇）黑腹果蝇P、F1、F2 （3）其他材料）其他材料-0.2g1份（份（3种果蝇样品种果蝇样品+2种其他）种其他）/小组小组 果蝇用自己存的材料。果蝇用自己存的材料。材料：材料：1.提取粗提取粗DNA液液现在先做现在先做（合理分工、协调时间）：（合理分工、协调时间）：每份材料（普通果蝇每份材料（普通果蝇20只、大果蝇只、大果蝇10只、或其他材料只、或其他材料0.2g）+50L匀浆缓匀浆缓冲液匀浆冲液匀浆液体倒入液体倒入1.5ml离心管离心管+等等V苯酚苯酚-氯仿氯仿（1:1）颠倒混匀）颠倒混匀30s,12000rpm，5分钟。分钟。助教把握时间助教把握时间！+50L10%SDS颠倒混匀颠倒混匀20s，65度水浴度水浴30min加入加入200L的匀浆液的匀浆液10000rpm，3min，转移上清。转移上清。移上清于另一离心移上清于另一离心管，管，+等等V苯酚苯酚-氯仿氯仿（1:1）颠倒混匀，）颠倒混匀，13000rpm，5分钟。分钟。12000rpm，10min移上清于另一离心移上清于另一离心管，加入管，加入2倍体积倍体积的无水乙醇，静置的无水乙醇，静置10min。弃上清，弃上清，70%乙醇洗乙醇洗涤沉淀涤沉淀，10000rpm，3min弃上清，超净台吹弃上清，超净台吹干沉淀。加入干沉淀。加入20ul的无菌水，溶解沉的无菌水，溶解沉淀，备用。淀，备用。注意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，注意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，枪头从液面上层往下层缓慢的移动，不要带入其它杂质。枪头从液面上层往下层缓慢的移动，不要带入其它杂质。（1）组织匀浆液组织匀浆液（已经准备好）（已经准备好）：LiCl0.40molL-1TrisHCl0.20molL-1（pH9.0）EDTA2.5mmolL-1RNaseA100gL-1（2）SDS10%（已经准备好）（已经准备好）相关试剂相关试剂(3)25xTAE(在在15离心时配制离心时配制)500ml用于后边的电泳用于后边的电泳 Tris12.1g冰醋酸冰醋酸2.86mLNa2EDTA2H2O1.86gddH2O定容到定容到100mL(一人配置，全班公用，用时稀释一人配置，全班公用，用时稀释)三、实验原理三、实验原理:RAPD:建立在建立在PCR基础上的一种分子标记。基础上的一种分子标记。模板高温变性模板高温变性足够低的温度下（通常为足够低的温度下（通常为36）与随机引）与随机引物（一般物（一般10个个bp）退火）退火PCR电泳电泳如果两个退火位点足够近（如果两个退火位点足够近（200-2000bp左右）、分别位左右）、分别位于互补的于互补的DNA链上，可以通过链上，可以通过PCR扩增出扩增出DNA片段。片段。引物结合位点引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之序列的改变以及两扩增位点之间间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过目和长度的差异，经电泳分离后通过EB染色以检测染色以检测DNA片段的多态性。片段的多态性。若位点若位点2处碱基发生改变，则处碱基发生改变，则3.RAPD反应反应1在在0.2mlPCR管中配制管中配制20l反应体系反应体系随机引物随机引物1LddH2O6L每组领取每组领取5份样品所需量份样品所需量各组等分各组等分5份份分别加分别加5种样品的模板种样品的模板DNA各各3L包括包括dNTPMixture,Taq酶酶,10PCRbufferPCRmixture10L 2在在PCR热循环仪中进行如下反应：热循环仪中进行如下反应：94200s9460s3660s72120s40个循环个循环72(300s-600s)4电泳（后继课中电泳（后继课中*）1.5%琼脂糖凝胶（用琼脂糖凝胶（用20mL的的1TAE溶解琼脂糖溶解琼脂糖配制）电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条配制）电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并带的不同，并照相照相记录。记录。*第第12周周“非中断杂交实验非中断杂交实验”的的“扩菌、倒所有的平板扩菌、倒所有的平板”步骤后步骤后（可以由一个同学提前一会儿进行）（可以由一个同学提前一会儿进行）操作分工操作分工技术问题技术问题注意事项注意事项实验课老师实验课老师助教指导：助教指导：实验报告（为果蝇系列实验的最后部分）实验报告（为果蝇系列实验的最后部分）：1.简单体现简单体现RAPD的实验原理、解决的问题；的实验原理、解决的问题；2.实验结果（照片）显示出来（信号弱的可用画实验结果（照片）显示出来（信号弱的可用画模式图辅助体现），标出样品名称、差异条带等，进行分模式图辅助体现），标出样品名称、差异条带等，进行分析。析。补充知识（课后阅读）：补充知识（课后阅读）：RAPDRFLPAFLPSTRSNPn n利用利用1010个碱基的一个或几个随机引个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增物非定点地扩增DNADNA片段，一般一个片段，一般一个引物可扩增引物可扩增6-126-12条条DNADNA片段，利用片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。基因多态性研究。n nRAPDRAPD是一种能快速进行基因多态是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。便易行。RAPD是英文是英文Restriction Fregrmeat Length Po1ymorRestriction Fregrmeat Length Po1ymor PhismPhism的缩写，意思是的缩写，意思是“限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性”。RFLPRFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNADNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNADNA的克隆，位的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)(Mark)，构建分子图谱。，构建分子图谱。RFLPRFLPRFLPAFLP:Amplified Fragment Length Polymorphism.AFLP technology combines the power of Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)with the flexibility and power of PCR.“AFLP”续：续：由于变异、进化，一种引物可以使某一由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的品系的DNA片段复制（扩增），而不能使另片段复制（扩增），而不能使另一品系的一品系的DNA片段复制（扩增）。片段复制（扩增）。电泳分离：同一引物扩增电泳分离：同一引物扩增品系品系1品系品系2引物如：引物如：EcoRI和和MseI相关相关引物引物荧光标记全自动荧光标记全自动AFLP原理与方法原理与方法短串联重复序列短串联重复序列STRs (short tendem repeats,mini-satellites)STR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是基本单位是1bp-8bp的的串联重复，串联重复，重复次数重复次数 n=15-60，已知，已知8000多个，多个，主要形式为：主要形式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以其中以(CA)n，(GT)n 为多见。为多见。1992年，年，Welssenbanch等以等以STR为标记的为标记的第二代连锁图取代了第二代连锁图取代了RFLP连锁图连锁图。可变数目可变数目串联重复序列串联重复序列VNTRs(variable number tandem repeats)每个每个 VNTR 都含有都含有10-15 bp核心序列，核心序列，VNTR与与STR比较类似，但是重复顺序更长；比较类似，但是重复顺序更长；多态性及分布方面不如多态性及分布方面不如STR，因而，因而VNTR作作为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，但是，但是，VNTR曾经对曾经对STR的基因定位运用起到的基因定位运用起到推动作用。推动作用。定义：不同个体间，基因组定义：不同个体间，基因组DNA某部位的某部位的 单核苷酸的变异。单核苷酸的变异。1996年，年，Lander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性标记（标记（single nucleotid polymorphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。制备第三代遗传连锁图的遗传标记。可通过杂交、序列分析、电泳等检测。可通过杂交、序列分析、电泳等检测。单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）1，The most abundant DNA marker present in the human genome，about 90%of sequences variants in human are SNP.There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs.2，A few hundred thousand are currently identified,but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated.3,SNPs in coding regions of genes have been termed cSNPs,about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene.Frequency of SNP in Human Genome1,Neutral alteration:a base substitution with no effect on the amino acid residue encoded.2,Conservative change:a base substitution that results in an altered amino acid,but has minimal effect on protein structure or function.3,Non-conservative alteration:leading to a change in the encoded amino acid residue that has dramatic effects on protein structure or function.The Functional Effects of cSNPs Major changes in protein structure can result from subtle variation in the genetic sequence encoding it.These changes can completely block the function of the protein in vivo and can also affect the development of high-throughput(高通亮高通亮)assays for screening therapeutic compounds.