流式细胞术常见实验分析.pptx

四种常见流式实验讲解四种常见流式实验讲解林奕婷林奕婷2013年年8月月14日日1.Guava easycyte 8HT 操作流程操作流程2.四种常见流式细胞术四种常见流式细胞术v 细胞凋亡的检测与分析v DNA含量检测与细胞周期分析v 胞内活性氧水平的检测与分析v 细胞表面分子的检测与分析v 组合实验1.Guava easycyte 8HT 1.Guava easycyte 8HT 操作流程操作流程操作流程操作流程 Incyte Incyte模块模块1.1 开机-清洗（原则：先开仪器后开软件，开机必清洗）1.2 采集样本1.3 分析1.4 关机（原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗）1.5 日常维护1.1 清洗清洗1.2 样本采集样本采集edit WL1.3 分析 见具体实验的分析。1.4 关机1.5 日常维护日常维护保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。桌面不要有震动，以免光路发生偏移。上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，流式专用的物品请不要带走。做完请记得登记。每周在周一进行一次easycheck。（自己在做实验之前也可进行easycheck，流程见下面。）微珠：10L（用前震荡混匀）Buffer：190Leasycheckeasycheck2.2.四种常见流式细胞术四种常见流式细胞术四种常见流式细胞术四种常见流式细胞术2.1 细胞凋亡的检测与分析2.1.1 PI单染法2.1.2 Annexin-PI双染法2.1.3 线粒体膜电位法凋亡启动凋亡启动凋亡早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期2.1.1 PI单染法单染法正常细胞DNA含量：2n4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）。基本原理：基本原理：操作方法与结果分析见细胞周期部分。操作方法与结果分析见细胞周期部分。优缺点：优缺点：优点：简便，快捷，价廉，应用普遍。缺点：2.1.2 Annexin-PI双染法双染法基本原理：基本原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素（Annexin）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜。正常细胞：膜完整，PS不外翻PI-/Annexin-凋亡早期：膜完整，PS翻转PI-/Annexin+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加PI+/Annexin+坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻PI+/Annexin+几乎不存在膜结构PI+/Annexin-结果分析结果分析阴性对照PIPI/Annexin-FITCAnnexin-FITC荧光交叠荧光交叠荧光补偿原理荧光补偿原理荧光补偿荧光补偿Annexin-FITC单染优缺点：优缺点：2.1.3 线粒体膜电位法线粒体膜电位法基本原理：基本原理：-+488nm590nm正常细胞正常细胞线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1：亲脂性阳离子荧光染料，特异性地与线粒体内膜结合，膜电位高时呈聚合体，膜电位低时呈单体。凋亡细胞凋亡细胞-+488nm529nm结果分析结果分析用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体）和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色荧光与黄色荧光阳性百分率之比。Ratio=G.M./Y.M.比值升高，膜电位降低，膜受损。2.2 DNA2.2 DNA含量检测与周期分析含量检测与周期分析含量检测与周期分析含量检测与周期分析2.2.1 DNA倍体分析PI染色法2.2.2 S期特异性检测2.2.3 M期特异性检测2.2.1 DNA倍体分析倍体分析PI染色法染色法细胞周期与DNA含量变化极其FCM分析直方图基本原理：基本原理：结果分析结果分析 Guava原软件分析Red-ARed-WRed-WRed-AH A W在用第三方软件分析之前，请将流式结果按如下所示导出。结果分析结果分析 Modfit软件分析结果分析结果分析 Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C结果分析结果分析 Flowjo软件分析2.2.2 S期特异性检测期特异性检测S期DNA合成期，S期的比例增多往往与细胞分裂的活跃程度相关。传统的PI染色可以通过DNA的倍增区分G1期与G2/M期。S期则因界限不明显，难以区分。若需要准确的统计S期的变化，需要加入S期的特异性标志，即BrdU。BrdU只在DNA合成时被掺入核酸，是指示DNA复制的金标准。因此可通过BrdU-Alex Fluor 488与PI复染将S期准确的区分开来。2.2.3 M期特异性检测期特异性检测G2期是指DNA合成后期，M期是细胞分裂期。二者在细胞周期事件中所处的时项不同，所表示的生物学意义也大不相同。准确检测M期的变化对细胞增殖、凋亡及癌症的研究相当重要。M期的检测标志是丝氨酸磷酸化组蛋白H3(pH3)。当细胞周期从G2期转换到M期时，染色质上的组蛋白H3Ser10发生磷酸化，并在有丝分裂后快速的去磷酸化。由此组蛋白H3的丝氨酸磷酸化变化将停留在G2期的细胞与M期的分裂细胞区分开来。2.3 2.3 胞内活性氧水平的检测与分析胞内活性氧水平的检测与分析胞内活性氧水平的检测与分析胞内活性氧水平的检测与分析DCFH-DA单染法DCFH-DADCFHROSDCFDCFH-DA进入细胞在细胞内酯酶作用下脱去二脂形成不发荧光的DCFH，当细胞内存在H2O2，O2-，OH-等ROS时被氧化成发绿色荧光的DCF。注意事项：注意事项：（1）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显结果分析结果分析 数据分析中几种常见图形及分析原则分析原则：分析原则：根据阴性对照界定阴性置信区；允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）一般小于1%5%；可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。（2）样本管与阴性对照管峰形重叠）样本管与阴性对照管峰形重叠样本管峰形左侧右移，右侧有肩峰，弱阳性的样本常出现此类图形。分析原则：分析原则：根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区应设在两曲线分离处；可记录阳性细胞百分率（近似值）或平均荧光强度或弱阳性；允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）高些，但阳性细胞百分率（近似值）应减去假阳性率。样本管峰形整体右移。在排除非特异性染色的情况下（如设置严格的对照、调节抗体浓度等），方能进行分析。分析原则：分析原则：不可根据阴性对照界定阴性置信区；可记录平均荧光强度，不可记录阳性细胞百分率。（3）同时出现弱阳性峰与强阳性峰的组合图形）同时出现弱阳性峰与强阳性峰的组合图形分析原则：分析原则：根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区可设在两曲线分离处。阳性细胞既含弱阳性细胞又含强阳性细胞，但阳性细胞百分率应减去假阳性率；界定先可设在弱阳性返回基线处，阳性细胞仅表示强阳性细胞；可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。2.4 2.4 细胞表面分子的检测与分析细胞表面分子的检测与分析细胞表面分子的检测与分析细胞表面分子的检测与分析2.4.1 免疫学检测2.4.2 干细胞分析2.4.1 免疫学检测免疫学检测数据分析数据分析2.4.2 肿瘤干细胞分析肿瘤干细胞分析MCF-7 negative controlMCF-7 CD24MCF-7 CD44MCF-7 CD24/CD440.08%0.03%89.8%5.35%侧群细胞侧群细胞细胞周期特异性凋亡检测：Annexin染色后用透膜固定剂固定，然后加入PI进行DNA染色。2.5 2.5 组合实验组合实验组合实验组合实验报告基因与细胞周期结合报告基因与细胞凋亡结合GPF-GFP+TotalROS与细胞活性结合DCFH/PI染色法干细胞分析与细胞活性结合表面标志物抗体/PI染色法