液相色谱研.pptx

4.1 HPLC 概述概述一一 HPLC 的的优点优点 高效：高效：n=3*104片片/米米 高压高压:150350105Pa 高速高速:小于小于1h 应用范围广（可分析应用范围广（可分析80%有机化合物）有机化合物）二二 HPLC的缺点的缺点 设备、柱填充剂和流动相比气相色谱贵，普及设备、柱填充剂和流动相比气相色谱贵，普及应用受到限制；定性分析时需要与质谱、核磁共振应用受到限制；定性分析时需要与质谱、核磁共振谱及红外光谱等技术联用谱及红外光谱等技术联用 类型类型功能功能柱内径柱内径 粒度粒度柱效柱效能否能否在线在线周期周期 输液输液方式方式LC分离分离13cm100m低低否否长长常压常压HPLC分离分离分析分析26mm10m高高能能短短高压高压主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段三三 HPLC与经典与经典LC比较比较四四 HPLC与与GC比较比较相同：相同：兼具兼具分离和分析分离和分析功能，均可以功能，均可以在线检测在线检测 差别：差别：分析对象，流动相分析对象，流动相和和操作条件操作条件的差别的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；占有机物的品；占有机物的20%HPLC：不受样品不受样品挥发性挥发性和和热稳定性热稳定性的限制，的限制，分子量大分子量大、难气化、热稳定性差及、难气化、热稳定性差及离子型样品离子型样品均均可检测；占有机物的可检测；占有机物的80%2 2流动相差别流动相差别GC:流动相为流动相为惰性惰性气体，组分与流动相气体，组分与流动相无作用力无作用力HPLC:流动相为流动相为非惰性非惰性液体，流动相与组分间液体，流动相与组分间有作用力有作用力流动相流动相种类种类较多，选择余地广较多，选择余地广流动相流动相极性和极性和pHpH值值的选择也对分离起到重要作用的选择也对分离起到重要作用选用选用不同比例不同比例的两种或两种以上液体作为流动相的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3 3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）高效液相色谱仪：高效液相色谱仪：高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统记录系统记录系统4.2 HPLC 仪器仪器工作过程图工作过程图HPLC仪器简化图仪器简化图HPLC 仪器实物图仪器实物图1 1高压输液系统高压输液系统 （1 1）溶剂贮存器）溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料玻璃、不锈钢或氟塑料制成，制成，容量为容量为1 1到到2L2L。用来贮存足够数量，符合要求的。用来贮存足够数量，符合要求的流动相流动相 （2 2）高压泵）高压泵 1 1）对泵的要求）对泵的要求：输出压力高、流量范围大、：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好 2 2）恒流泵）恒流泵 优点优点:流量流量不受不受流动相粘度流动相粘度和色谱体系中和色谱体系中其余部分其余部分阻力阻力变化的影响、易于调节控制，死体积小，便变化的影响、易于调节控制，死体积小，便于清洗和更换流动相，很适于梯度洗脱于清洗和更换流动相，很适于梯度洗脱 缺点缺点:输出有输出有脉冲脉冲波动波动 类型：类型：机械注射式机械注射式和和机械往复式机械往复式，为减小脉动，为减小脉动，常用常用双泵双泵体系并加脉冲阻尼器体系并加脉冲阻尼器单活塞往复泵单活塞往复泵双活塞往复泵双活塞往复泵 3 3）恒压泵）恒压泵 优点：优点：能供给能供给压力恒定压力恒定、无脉动无脉动的输出，并能提的输出，并能提供大的输出流量供大的输出流量 缺点：缺点：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频繁更换流动相的选择合适溶剂的实验，也不于频繁更换流动相的选择合适溶剂的实验，也不便于梯度洗脱便于梯度洗脱 驱动气体进口驱动气体进口恢复气体进口恢复气体进口（3）在线脱气装置）在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气溶解气体体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱，脱气不好时有柱，脱气不好时有气泡气泡，导致流动相，导致流动相流速流速不稳定不稳定，造成，造成基线漂移，噪音增加基线漂移，噪音增加,也可采也可采用用超声脱气超声脱气和和真空脱气真空脱气 （4）梯度淋洗）梯度淋洗 在分离过程中使在分离过程中使两种两种或或两种以上两种以上不同极性的溶剂不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的按一定程序连续改变它们之间的比例比例，从而使流动，从而使流动相的相的强度、极性、强度、极性、pH值或离子强度值或离子强度相应地变化，相应地变化，达到达到提高分离效果、缩短分析时间提高分离效果、缩短分析时间的目的的目的 ABABCC 梯度洗脱装置有两类：梯度洗脱装置有两类：A 低压梯度低压梯度:又称又称外梯度外梯度，先混合后加压先混合后加压B 高压梯度高压梯度:又称又称内梯度内梯度，先加压后混合先加压后混合2进样装置进样装置 1）隔膜注射进样隔膜注射进样：使用：使用微量注射器微量注射器进样，装置简进样，装置简单、死体积小；但单、死体积小；但进样量小且重现性进样量小且重现性差差 2）高压定量进样阀高压定量进样阀：目前最常用的为：目前最常用的为六通阀六通阀。由。由于进样量可由样品管控制，因此于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复进样准确，重复性好性好 3色谱柱色谱柱 （1）概述：）概述：色谱柱一般用内部抛光的色谱柱一般用内部抛光的不锈钢不锈钢（玻玻璃，铝，铜璃，铝，铜）制成，）制成，目前常用的标准柱型是目前常用的标准柱型是内径内径为为4.6或或3.9mm，长度为，长度为1530cm的直形不锈钢柱，的直形不锈钢柱，填料颗粒度为填料颗粒度为510m，内部充满微粒固定相，内部充满微粒固定相，柱温一般为柱温一般为室温室温或接近室温或接近室温（2）柱的填充）柱的填充1）干法）干法：填料粒度大于：填料粒度大于20m，在硬台面上铺上在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏漏斗斗每次灌入每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩填料，然后垂直台面墩10-20次次2）湿法）湿法：填料粒度小于：填料粒度小于20m，先将填料调成，先将填料调成匀匀浆浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用柱型柱型内径内径柱长柱长填料粒度填料粒度GC填充柱填充柱2 6mm2 4m柱内径的柱内径的1/20-1/25(100m)GC毛细管毛细管柱柱0.1 0.5mm几十米几十米几百米几百米无填料无填料HPLC色谱色谱柱柱2 6mm10 50cm5 10m（3）GC,HPLC色谱柱色谱柱的比的比较较4 4检测器检测器（1 1）对检测器的要求）对检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等不敏感等（2 2）检测器的类型）检测器的类型：一类是：一类是溶质性溶质性检测器，它仅检测器，它仅对对被分离组分被分离组分的的物理或物理化学特性物理或物理化学特性有响应，有响应，属于此类检测器的有属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测紫外、荧光、电化学检测器器等；另一类是等；另一类是总体总体检测器，它对检测器，它对试样和洗脱试样和洗脱液液总的物理和化学性质响应，属于此类检测器总的物理和化学性质响应，属于此类检测器有有示差折光检测器示差折光检测器等等 1）紫外光度检测器紫外光度检测器 原理原理：待测组分对特定波长的紫外光的：待测组分对特定波长的紫外光的选择性吸选择性吸收收，组分浓度与吸光度的关系遵守，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律比尔定律 固定波长固定波长的紫外可见光检测器的紫外可见光检测器：通常用汞灯的通常用汞灯的254nm或或280nm谱线谱线可调波长的紫外可见光检测器可调波长的紫外可见光检测器：装有流通池的紫装有流通池的紫外可见分光光度计外可见分光光度计，不仅可以选择适当的检测波，不仅可以选择适当的检测波长，还可以记录组分的紫外吸收光谱，即当组分长，还可以记录组分的紫外吸收光谱，即当组分通过流通池时，通过流通池时，短时间中断液流快速扫描（停流短时间中断液流快速扫描（停流扫描），扫描），可以得到组分的紫外光谱图，为定性分可以得到组分的紫外光谱图，为定性分析提供信息，或据此选择最佳检测波长析提供信息，或据此选择最佳检测波长 紫外光度检测器特点紫外光度检测器特点 灵敏度高；应用范围广；流通池可做的很灵敏度高；应用范围广；流通池可做的很小（小（1mm10mm，容积，容积8L）；对流动相的）；对流动相的流速和温度流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于可用于梯度洗脱梯度洗脱；溶剂必须能让所选择的光透；溶剂必须能让所选择的光透过，即过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长所选波长不能小于溶剂的最低使用波长 紫外光电二极管阵列检测器原理紫外光电二极管阵列检测器原理 采用光电二极管阵列作检测元件，阵列由采用光电二极管阵列作检测元件，阵列由2001000个光电二极管组成，每一个二极管测量一段个光电二极管组成，每一个二极管测量一段波长的光谱。具有组分特征吸收的全部波长经光波长的光谱。具有组分特征吸收的全部波长经光栅分光后栅分光后同时同时被检测被检测 由于采用由于采用电子学电子学方法和方法和计算机计算机技术可以对二极管技术可以对二极管阵列阵列快速扫描采集快速扫描采集数据，扫描速率非常快，低于数据，扫描速率非常快，低于10-2s，远大于色谱峰流出速率，因此，远大于色谱峰流出速率，因此勿需停流扫勿需停流扫描描即可获得动态光谱吸收图即可获得动态光谱吸收图紫外光电二极管阵列检测器紫外光电二极管阵列检测器紫外光电二极管阵列检测器特点紫外光电二极管阵列检测器特点 同时获得同时获得信号强度值是保留时间和波长信号强度值是保留时间和波长的的函数，即获得函数，即获得三维色谱图三维色谱图，同时获得多种信，同时获得多种信息，使得每个组分在整个波长范围内的息，使得每个组分在整个波长范围内的光谱光谱信息信息大大增加，可迅速获得大大增加，可迅速获得最佳选择性和灵最佳选择性和灵敏度敏度的波长的波长2 2）荧光检测器）荧光检测器 原理：原理：光照射样品，光照射样品，组分受到激发跃迁至组分受到激发跃迁至激发态，返回基态的激发态，返回基态的过程中发射的谱线，过程中发射的谱线，谱线强度与组分含量谱线强度与组分含量成正比成正比 荧光检测器的特点荧光检测器的特点优点：优点：灵敏度高灵敏度高（比紫外检测器的灵敏度高（比紫外检测器的灵敏度高2个个数量级）、数量级）、选择性好选择性好（不同物质所产生荧光波长（不同物质所产生荧光波长不同）、不同）、样品用量少样品用量少缺点：缺点：应用范围小应用范围小，只能用于在紫外光下能产生，只能用于在紫外光下能产生荧光的物质或能制成荧光衍生物的物质，对于不荧光的物质或能制成荧光衍生物的物质，对于不发荧光的物质不能检测，而且线性范围较小，通发荧光的物质不能检测，而且线性范围较小，通常仅约为常仅约为1000应用：应用：荧光检测器常用于荧光检测器常用于酶、甾族化合物、维生酶、甾族化合物、维生素、氨基酸素、氨基酸以及某些以及某些药物药物的分析的分析 3）示差折光检测器示差折光检测器 原理原理：利用两束相同角度的光照射：利用两束相同角度的光照射流动相流动相和和样品样品+流动相流动相，二者对光的，二者对光的折射率折射率不同，折射率之差即不同，折射率之差即表示试样在流动相中的浓度表示试样在流动相中的浓度优点：优点：由于每种物质几乎都有各自不同的折射率，由于每种物质几乎都有各自不同的折射率，因此都可以用示差折光检测器来检测，因此都可以用示差折光检测器来检测，示差折光示差折光检测器是一种通用型检测器，对所用物质都有响检测器是一种通用型检测器，对所用物质都有响应应，如同气相色谱仪的热导检测器，如同气相色谱仪的热导检测器缺点缺点:(1):(1)灵敏度较低灵敏度较低;(2);(2)对对温度和流量变化温度和流量变化敏感，敏感，必须精确控制温度和流量必须精确控制温度和流量;(3);(3)不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱。一般一般用于无紫外吸收的物质用于无紫外吸收的物质 4）电导检测器）电导检测器 原理原理：是基于：是基于待测物待测物在一些介质中电离后所产在一些介质中电离后所产生的生的电导变化电导变化来测量电离物质的来测量电离物质的含量含量。电导检。电导检测器的主要部件是测器的主要部件是电导池电导池 特点：特点：电导检测器对分子不响应，对电导检测器对分子不响应，对离子离子则是则是通用型通用型的，它的，它对温度和流量敏感对温度和流量敏感，因此必须严，因此必须严格控制温度和流量，并且格控制温度和流量，并且不适用于梯度洗脱不适用于梯度洗脱原理原理：从色谱柱中流出的流：从色谱柱中流出的流动相进入雾化室动相进入雾化室,在雾化气体在雾化气体作用下作用下,样品组分生成样品组分生成气溶胶气溶胶，之后溶剂逐渐蒸发，形成只之后溶剂逐渐蒸发，形成只含溶质的含溶质的微小颗粒微小颗粒，微小颗，微小颗粒在强光照射下产生光散射粒在强光照射下产生光散射,散射光与组分含量成正比散射光与组分含量成正比5.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 蒸发光散射检测器是蒸发光散射检测器是质量型、通用检测器质量型、通用检测器，特别适合无紫外吸收的样品，主要应用于特别适合无紫外吸收的样品，主要应用于糖类、糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、甾类高级脂肪酸、磷脂、维生素、甾类等化合物等化合物 使用此检测器条件是使用此检测器条件是组分必须能雾化并且能组分必须能雾化并且能形成小颗粒形成小颗粒,流动相不能含有不挥发的盐类流动相不能含有不挥发的盐类 HPLC一般都带有数据处理系统或一般都带有数据处理系统或色谱工作色谱工作站站，除记录，除记录色谱图色谱图外，还能自动记录峰的外，还能自动记录峰的保保留时间留时间,自动对自动对峰面积峰面积积分积分 5 数据记录和结果处理系统数据记录和结果处理系统 一一 对流动相的要求对流动相的要求 （1 1）纯纯度度要要高高：一一般般用用色色谱谱纯纯试试剂剂，还还要要进进一一步步纯纯化化；使使用用前前要要过过滤滤除除去去微微粒粒以以免免堵堵塞塞；脱脱气气，以以免免在在柱柱中中或或检检测测器器中中产产生生气气泡泡而而影影响响分分离离和和检检测测4.3 HPLC流动相和固定相流动相和固定相（2 2）与固定相不互溶、不反应：）与固定相不互溶、不反应：即不能使用能即不能使用能引起引起柱效损失柱效损失或或保留特性变化保留特性变化的溶剂，如吸附的溶剂，如吸附色谱法的流动相不能含水，硅胶色谱柱不能用色谱法的流动相不能含水，硅胶色谱柱不能用碱性溶剂，液液色谱法中流动相应该与固定相碱性溶剂，液液色谱法中流动相应该与固定相互不相溶以免引起固定相流失等互不相溶以免引起固定相流失等（3 3）溶剂对于试样要有适宜的溶解度：）溶剂对于试样要有适宜的溶解度：以免试样以免试样在柱中在柱中沉淀沉淀而造成堵塞，更换流动相时必须保而造成堵塞，更换流动相时必须保证互溶证互溶（4）粘粘度度适适中中：若若使使用用高高粘粘度度溶溶剂剂，势势必必增增高高压压力力，不不利利于于分分离离，常常用用的的低低粘粘度度溶溶剂剂有有丙丙酮酮、乙乙醇醇、乙乙腈腈等等；但但粘粘度度过过于于低低的的溶溶剂剂也也不不宜宜采采用用，例例戊戊烷烷、乙乙醚醚等等，它它们们易易在在色色谱柱谱柱或检测器内形成或检测器内形成气泡气泡，影响分离，影响分离 （5）溶剂要与检测器匹配）溶剂要与检测器匹配 紫外光度检测器紫外光度检测器：应注意选用：应注意选用检测器波长比溶剂检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长的紫外截止波长要长 溶剂的紫外截止波长溶剂的紫外截止波长：当小于截止波长的辐射通：当小于截止波长的辐射通过溶剂时过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的剂被看作是光学不透明的 示差折光检测器：示差折光检测器：要求选择与组分要求选择与组分折光率折光率有较大有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度二二 固定相固定相 1.按承受压力分按承受压力分 刚性固体刚性固体：SiO2为基质，耐压为为基质，耐压为7.0108 1.0109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于主要用于吸附、分配和键合吸附、分配和键合色谱色谱 硬硬 胶胶：以：以聚合物聚合物为基质为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成交联而成)，耐压上限为，耐压上限为3.5108 Pa,主要用于主要用于离离子交换子交换和和尺寸排阻尺寸排阻色谱色谱2.2.按孔隙深度分按孔隙深度分表面多孔型表面多孔型：以：以实心玻璃珠实心玻璃珠为基体，在基体表为基体，在基体表面覆盖一层面覆盖一层多孔活性材料多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固。表面多孔型固定相的定相的颗粒大颗粒大(易装柱易装柱)、多孔层厚度小且、多孔层厚度小且孔浅孔浅(渗透性好，出峰快渗透性好，出峰快)；但；但交换容量小交换容量小；适于；适于常常规分离规分离分析分析全多孔型全多孔型：全部由：全部由硅胶硅胶或或氧化铝氧化铝微粒聚集而成，微粒聚集而成，因因颗粒极细颗粒极细，因而，因而孔径小孔径小、传质快、柱效高；、传质快、柱效高；特别适于特别适于复杂混合物复杂混合物的分离的分离4.4 HPLC主要类型及分离原理主要类型及分离原理一一吸附色谱吸附色谱 1 原理原理 各各组分组分与与流动相分子流动相分子争夺争夺吸附剂表面活性中心，吸附剂表面活性中心，利用利用吸附剂对不同组分的吸附剂对不同组分的吸附能吸附能力差异力差异实现分离实现分离2 2 固定相固定相 一般为一般为吸附活性强弱不等吸附活性强弱不等的吸附剂：的吸附剂：极性吸极性吸附剂附剂包括包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺子筛及聚酰胺等，等，非极性吸附剂非极性吸附剂最常见的是最常见的是活活性炭性炭 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。吸附剂。酸性吸附剂酸性吸附剂包括包括硅胶和硅酸镁硅胶和硅酸镁等，适等，适于分离于分离碱碱，如，如脂肪胺和芳香胺脂肪胺和芳香胺；碱性吸附剂碱性吸附剂有有氧化铝、氧化镁和聚酰胺氧化铝、氧化镁和聚酰胺等，适于分离等，适于分离酸性溶酸性溶质质，如，如酚、羧酸和吡咯衍生物酚、羧酸和吡咯衍生物等等 3 流动相流动相 在吸附色谱中，选择流动相主要考虑在吸附色谱中，选择流动相主要考虑溶剂的极性溶剂的极性，选择原则是：选择原则是：极性大的试样需要用极性强的洗脱剂，极性大的试样需要用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性较弱的洗脱剂极性弱的试样宜用极性较弱的洗脱剂 洗脱剂的极性强弱可用洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（溶剂强度参数（0）来衡来衡量。量。0越大，表示洗脱剂的极性越强。表越大，表示洗脱剂的极性越强。表20-4列出一列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂值。在硅胶吸附剂中中0值的顺序相同，数值可换算（值的顺序相同，数值可换算（0硅胶硅胶=0770氧化氧化铝）铝）4 4 应用应用几何异构体几何异构体:当当组分分子结构组分分子结构与与吸附剂表面活性吸附剂表面活性中心的刚性几何结构中心的刚性几何结构相适应时易于吸附，从而相适应时易于吸附，从而使吸附色谱成为分离异构体的有效手段，使吸附色谱成为分离异构体的有效手段，如农如农药异构体分离药异构体分离 按族分离化合物按族分离化合物:不同的官能团不同的官能团具有不同的吸附具有不同的吸附能，如能，如石油中烷、烯、芳烃的分离石油中烷、烯、芳烃的分离对于对于同系物没有选择性同系物没有选择性，不能用该法分离分子，不能用该法分离分子量不同的同系物量不同的同系物 二二 分配色谱分配色谱 1 原理原理 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶溶解度解度不同，因而具有不同的不同，因而具有不同的分配系数分配系数2 流动相流动相 HPLC分析中，为防止固定相的流失，流分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应动相与固定液应尽量不互溶尽量不互溶，或者说，或者说二者的二者的极性相差越大越好极性相差越大越好 因此，根据流动相与固定相因此，根据流动相与固定相极性的差别极性的差别程程度，可将液液色谱分为度，可将液液色谱分为正相分配色谱正相分配色谱（流动流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于适于极性组分分离极性组分分离）和）和反相分配色谱反相分配色谱（流动流动相相极性大于固定相极性，极性大的先流出，极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于适于非极性组分分离非极性组分分离）正相色谱法和反相色谱法的区别如下：正相色谱法和反相色谱法的区别如下：正相色谱中随流动相极性增强，保留值减小正相色谱中随流动相极性增强，保留值减小反相色谱中随流动相极性增强，保留值增大反相色谱中随流动相极性增强，保留值增大关关于于溶溶剂剂的的极极性性，可可以以用用Snyder提提出出的的溶溶剂剂极极性性参参数数P来来表表示示，P越越大大，则则溶溶剂剂的的极极性性越越大大，P值值可可以以从从手手册册上查到，常用溶剂的上查到，常用溶剂的P值见下表：值见下表：溶剂P溶剂P正戊烷0.0四氢呋喃4.0正己烷0.1氯仿4.11-氯丁烷1.0乙醇4.3四氯化碳1.6乙酸乙酯4.4甲苯2.4甲乙酮4.7苯2.7丙酮5.1异丙醚2.4甲醇5.1乙醚2.8乙腈5.8二氯甲烷3.1乙酸6.0异丙醇3.9甲酰胺9.6正丙醇4.0水10.2 如果单一溶剂不能符合要求，可采用混合如果单一溶剂不能符合要求，可采用混合溶剂溶剂作为流动相，以改善分离效果。作为流动相，以改善分离效果。混合溶剂混合溶剂的极性参数的极性参数可以用下式计算：可以用下式计算：其中其中 为纯溶剂的为纯溶剂的极性参数极性参数，为溶为溶剂剂A,B所占的所占的体积分数体积分数 显然，改变溶剂的显然，改变溶剂的体积比体积比可以改变混合溶剂的可以改变混合溶剂的极性参数极性参数，通常溶剂极性参数应调节到使被分离，通常溶剂极性参数应调节到使被分离组分的容量因子组分的容量因子k在在25的最佳范围的最佳范围 如果试样组分的如果试样组分的极性范围较大极性范围较大，可采用，可采用梯梯度洗脱度洗脱，梯度洗脱时，梯度洗脱时，正相色谱法正相色谱法通常通常逐渐逐渐增大流动相中极性溶剂的比例增大流动相中极性溶剂的比例，而，而反相色谱反相色谱法与之相反，法与之相反，逐渐增大极性相对较低的甲醇逐渐增大极性相对较低的甲醇或乙腈的比例或乙腈的比例 如何选择合适的流动相？如何选择合适的流动相？例例如如：在在正正相相液液液液色色谱谱法法中中，可可先先选选中中等等极极性性的的溶溶剂剂为为流流动动相相，若若组组分分的的保保留留时时间间太太短短，表表示示溶溶剂剂的的极极性性太太大大；改改用用极极性性较较弱弱的的溶溶剂剂，若若组组分分保保留留时时间间太太长长，则则溶溶剂剂极极性性太太小小，然然后后再再在在上上述述两两种种溶溶剂剂极极性性之之间间选选择择，如如此此多多次实验，最后选定最适宜的溶剂次实验，最后选定最适宜的溶剂3 固定相固定相 液液色谱的固定相由液液色谱的固定相由载体载体和和固定液固定液组成组成（1）常用的载体有下列几类：）常用的载体有下列几类：1）表面多孔型载体表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直（薄壳型微珠载体），由直径为径为30 40 m的的实心玻璃球实心玻璃球和厚度约为和厚度约为1 2 m的的多孔性外层多孔性外层所组成所组成 2）全多孔型载体全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径直径30 50 m的的多孔型颗粒多孔型颗粒 3）全多孔型微粒载体全多孔型微粒载体，由，由nm级级的硅胶微粒堆积的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠，这种载体粒度为而成，又称堆积硅珠，这种载体粒度为5 10 m。由于颗粒小，由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体的一种载体 （2）固定液类型）固定液类型 由于液相色谱中，流动相参与选择作用，由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相流动相极性的微小变化极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的，都会使组分的保留值出现较大的差异；且差异；且HPLC固定液易流失固定液易流失，因此常用的只有，因此常用的只有几几种种，按极性由高到低为：，按极性由高到低为：,-氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇聚乙二醇(PEM)、十八烷、十八烷(C18)、角鲨烷、角鲨烷(SQ)（3）固定液涂渍方法）固定液涂渍方法 根据固定液涂渍方法的不同，可将固定相分为根据固定液涂渍方法的不同，可将固定相分为机机械涂渍型械涂渍型和和化学键合型化学键合型，后者应用更为广泛，后者应用更为广泛 1）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合将固定液通过机械混合的方法涂渍到的方法涂渍到表面多孔型表面多孔型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或或全全多孔型多孔型载体载体(5-10%涂布量涂布量)上形成的液液色谱固上形成的液液色谱固定相定相 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的的前置柱前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有，该柱涂有与分析柱相同但有更高含更高含量的固定液量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液被固定液饱和饱和机械涂渍的问题：机械涂渍的问题：1 1 选用选用与固定液不互溶的溶剂与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有色谱过程中固定液仍会有微量溶解微量溶解 2 2 流动相经过色谱柱的流动相经过色谱柱的机械冲击机械冲击，固定相会不，固定相会不断断流失流失 3 3 将流动相将流动相预先用固定相液体饱和预先用固定相液体饱和或在色谱柱或在色谱柱前加一个前加一个前置柱前置柱，但仍难以完全避免固定液的，但仍难以完全避免固定液的流失流失 该种固定相最大的不足是该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗 2）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相是通过化学键合固定相是通过化学反应化学反应将将有机分子键有机分子键合合在载体表面所形成的柱填充剂在载体表面所形成的柱填充剂 特点：特点：传传质质快快，表表面面无无深深凹凹陷陷，比比一一般般液液体体固固定定相相传传质质快快；寿寿命命长长，化化学学键键合合，无无固固定定液液流流失失，耐耐流流动动相相冲冲击击，耐耐水水、耐耐光光、耐耐有有机机溶溶剂剂；选选择择性性好好，可可键键合合不不同同官官能能团团，提提高高选选择择性性,有有利利于梯度洗脱于梯度洗脱键合相类型键合相类型t/min硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯反相键合色谱中，键合相碳链反相键合色谱中，键合相碳链越长极性越小，分离效果越好越长极性越小，分离效果越好C1C8C184 应用应用 液液色谱是基于化合物中液液色谱是基于化合物中取代基的数目或性质取代基的数目或性质不同，或化合物的不同，或化合物的相对分子量相对分子量不同达到分离的。不同达到分离的。能分析各种能分析各种不同性质的样品不同性质的样品，无论是无论是极性的和极性的和非极性非极性的，的，水溶性和油溶性的水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的和非离子型离子型的化合物的化合物 三三 离子交换色谱离子交换色谱 1 1 原理原理 利用离子交换树脂上利用离子交换树脂上可电离可电离的离子的离子与试样中与试样中待分离的离子待分离的离子进进行行可逆交换可逆交换，根据这些离子对交，根据这些离子对交换剂具有不同的换剂具有不同的亲和力亲和力进行分离进行分离2固定相固定相 （1）薄薄膜膜型型离离子子交交换换树树脂脂：在在载载体体表表面面涂涂渍渍约约1的离子交换树脂的离子交换树脂（2）离离子子交交换换键键合合固固定定相相：用用化化学学反反应应将将离离子子交交换基团键合在惰性载体表面换基团键合在惰性载体表面其中其中强酸性和强碱强酸性和强碱性性交换树脂比较稳交换树脂比较稳定，定，pHpH适用范围宽，适用范围宽，因此应用较多因此应用较多 3 流动相流动相 离子交换色谱流动相为离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液盐类缓冲溶液，通过改变，通过改变pH、缓冲剂类型和离子强度、缓冲剂类型和离子强度等条件来控制等条件来控制分配比分配比k，改变交换剂的，改变交换剂的选择性选择性，进而影响样品待测物的，进而影响样品待测物的分离分离 pH值值：影响酸或碱的离解平衡，：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形控制组分离子形式所占的分数式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不。当组分以分子形式存在时，则不被保留；被保留；离子分数越高，保留值越大离子分数越高，保留值越大。常用的有。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等等离子强度离子强度I I：组分保留值受流动相中盐类总浓度：组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。控制。增加外加阴阳离子将降低增加外加阴阳离子将降低样品离子的竞争样品离子的竞争吸附能力吸附能力，使组分保留值减小，使组分保留值减小。不同种类的盐对。不同种类的盐对交换剂的亲和能力不同，从而可影响柱的选择性交换剂的亲和能力不同，从而可影响柱的选择性阴离子的滞留次序阴离子的滞留次序:阳离子的滞留次序阳离子的滞留次序:4 应用应用 适用适用无机离子无机离子混合物的分离，亦可用于混合物的分离，亦可用于有有机物的分离机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广等生物大分子。因此，应用范围较广 离子交换色谱的局限离子交换色谱的局限：某些无机离子无：某些无机离子无紫外吸收，不能采用紫外吸收，不能采用紫外检测器紫外检测器进行分析进行分析四四 离子色谱离子色谱1 原理：原理：与与离子交换色谱离子交换色谱原理一样，只是采用原理一样，只是采用电导检测器电导检测器检测，但由于流动相都是强电解质，检测，但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约其电导率比待测离子约高高2个数量级个数量级，这种强背，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号景电导会完全掩盖待测离子信号 1975年年Small提出，在离子交换柱之后，再串提出，在离子交换柱之后，再串结一根结一根抑制柱抑制柱。该柱装填。该柱装填与分离柱电荷完全相与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检，从而可用电导检测器检测各种离子的含量测各种离子的含量例如：分析例如：分析阳离子阳离子时，以时，以无机酸无机酸为流动相，抑为流动相，抑制柱为高容量的制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂，则发，则发生下列反应：生下列反应：R+OH+HCl(流动相流动相)R+Cl-+H2OR+OH+MCl(待测物待测物)R+Cl-+M+OH-由反应可见：经抑制柱后，一方面将由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转大量酸转变为电导很小的水变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品影响。同时，又将样品阳离子阳离子M+转变成相应的转变成相应的碱碱，由于，由于OH-离子的淌度为离子的淌度为Cl-离子的离子的2.6倍倍，提，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理子样品也有相似的作用机理 该法的不足之处该法的不足之处：抑：抑制柱要制柱要定期再生定期再生、谱峰、谱峰在经过抑制柱后会在经过抑制柱后会展宽展宽，降低分离度降低分离度 因此有人提出了使用因此有人提出了使用电导率很低的溶液电导率很低的溶液(如如苯苯甲酸盐稀溶液甲酸盐稀溶液)作流动相作流动相称为称为非抑制型非抑制型离子色谱离子色谱或或单柱单柱离子色谱离子色谱2 离子色谱的固定相：离子色谱的固定相：离子交换树脂离子交换树脂3 离子色谱的流动相：离子色谱的流动相：盐类缓冲溶液盐类缓冲溶液4 离子色谱的应用离子色谱的应用：离子或可离解的化合物离子或可离解的化合物，不仅可应用于无机离子的分离，也可用于有不仅可应用于无机离子的分离，也可用于有机离子和糖类、氨基酸等生物大离子机离子和糖类、氨基酸等生物大离子 五五 离子对色谱离子对色谱 原原 理理:将一种（或数种）与将一种（或数种）与溶质离子电荷相反溶质离子电荷相反的的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成中，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对疏水性离子对，从，从而控制溶质离子而控制溶质离子保留行为保留行为的一种色谱法的一种色谱法 固定相固定相：加入对离子的分配或吸附色谱固定相：加入对离子的分配或吸附色谱固定相 流动相流动相：加入对离子的分配或吸附色谱流动相：加入对离子的分配或吸附色谱流动相阳离子阳离子/有机碱分析有机碱分析:烷基磺酸钠，烷基磺酸钠，如如己烷磺酸钠己烷磺酸钠作为对离子作为对离子阴离子阴离子/有机酸分析有机酸分析:季胺盐，季胺盐，如氢氧化四丁基铵如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子反相离子对色谱：反相离子对色谱：通常采用通常采用非极性的固定相非极性的固定相如十如十八烷基键合相，用含有八烷基键合相，用含有对离子对离子的甲醇水（或乙的甲醇水（或乙腈水）作为流动相腈水）作为流动相 应用：应用：强极性的有机酸和有机碱强极性的有机酸和有机碱 六六 尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法 1 原理：原理：利用被测组分利用被测组分分子分子大小大小不同、在固定相上不同、在固定相上选择选择性渗透（有机相），过滤性渗透（有机相），过滤（水相）（水相）实现分离实现分离2 2 排阻色谱固定相：凝胶排阻色谱固定相：凝胶（1）软质凝胶）软质凝胶，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，适用，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，适用于于水作流动相水作流动相，机械强度较小机械强度较小，只能在，只能在常压常压下使用下使用（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶，如交联聚苯乙烯，如交联聚苯乙烯,是应用最多的是应用最多的有机凝胶，比软质凝胶稍耐压，是有机凝胶，比软质凝胶稍耐压，是亲油性亲油性的，宜用的，宜用有机溶剂有机溶剂作流动相，作流动相，能耐较高压力能耐较高压力，流速不宜大流速不宜大（3）硬质凝胶）硬质凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃，其特点是，如多孔硅胶、多孔玻璃，其特点是化学稳定性、热稳定性、机械强度化学稳定性、热稳定性、机械强度都较好，可在柱都较好，可在柱中直接更换溶剂，在中直接更换溶剂，在较高压力和较高流速较高压力和较高流速下操作，下操作，缺点是有缺点是有吸附活性吸附活性，需要进行特殊处理，需要进行特殊处理3 排阻色谱流动相排阻色谱流动相 必须能必须能溶解样品溶解样品，并必须与凝胶本身非常相，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能似，这样才能润湿润湿凝胶。当采用软性凝胶时，凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶剂也必须能溶胀