液相色谱2011620.pptx

2024年8月25日Agilent 1200原理及结构原理及结构21.1.HPLCHPLC原理原理2.2.HPLCHPLC基本组成结构基本组成结构课程摘要课程摘要一、液相色谱原理3溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。HPLC和GC的比较4 GC HPLC 流动相流动相 g l温度温度 高温高温 室温室温组分组分 易挥发、热稳定性好易挥发、热稳定性好 不受限制不受限制可测有机物可测有机物 2075%80%tR 130min 160min灵敏度灵敏度 10-1210-14g/ml 10-910-11g流出物流出物 不易收集不易收集 易收集易收集 HPLC 优点：优点：应用范围广，组分易回收应用范围广，组分易回收5 GC与与 HPLC选择：选择：小分子小分子热稳定性好热稳定性好GC大分子大分子热稳定性差热稳定性差HPLC tR 短短GC优点：优点：g 廉价廉价 灵敏度高灵敏度高6 HPLC的特点 1.高效分离高效分离 n=105/米米 2.高速高速 使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟 3.高灵敏度高灵敏度 检测下限：检测下限：10-910-13g最小检测量）（最小检测量）4.应用范围广应用范围广 可侧有机物可侧有机物75%80%二、二、HPLCHPLC基本组成结构基本组成结构7手持控制器手持控制器检测器检测器 柱温箱柱温箱自动进样器自动进样器泵泵脱气机脱气机 溶剂柜溶剂柜优化流路减小死体积流路自上而下reserviorinjectorpumpcolumndetectorData system指示灯状态9指示灯状态指示灯状态通过通过LED显示仪器六种状态：显示仪器六种状态：关机（未通电）就绪（已开机）未就绪正在运行出现故障驻存升级出现严重故障灯熄灭灯熄灭黄灯绿灯红灯黄灯闪烁红灯闪烁102.12.1流动相流动相要求：要求：1、与固定相不互溶，不反应。、与固定相不互溶，不反应。2、对组分有适当溶解度。、对组分有适当溶解度。3、纯度高，使用前需过滤、脱气。、纯度高，使用前需过滤、脱气。4、粘度小（否则传质速度慢，柱效低，柱压高）、粘度小（否则传质速度慢，柱效低，柱压高）5、与检测器匹配。、与检测器匹配。112.12.1流动相流动相脱气：脱气：HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作气泡，影响泵的工作。若有气泡会影响若有气泡会影响 （1）输液系统正常工作使压力不稳，）输液系统正常工作使压力不稳，tR变化。变化。（2）进入检测器影响检测信号。）进入检测器影响检测信号。2.2 Agilent 1200真空脱气机 G1322A建议建议:低压混合进行梯度洗脱，提高泵的可靠性能。提高泵在低流速下的操作性能用于需要脱氧的检测器性能性能/用途用途:与He脱气相比，更方便，更节省费用。高性能脱气，避免了烦琐的操作，提高仪器稳定性。内部延迟体积小，便于快速进行溶剂切换。四通路系统，操作灵活。与1200其它组件堆积在一起，用遥控线连接，用于传输错误信号。12连接方式：连接方式：在线真空脱气机工作原理14流动相脱气流动相脱气吹氦脱气法吹氦脱气法加热回流法加热回流法抽真空脱气法抽真空脱气法超声波脱气法超声波脱气法在线真空脱气法在线真空脱气法使用真空脱气机可以降低噪音16不进行溶剂脱气处理使用氦气进行溶剂脱气使用安捷伦真空脱气机Absorbency123456789Time (min)溶剂:甲醇;紫外检测波长:210 nm使用真空脱气机可以保证保留时间的重现性17溶解酵素分析溶解酵素分析 2425262728296050403020100mAU第一次实验最后一次实验(30小时后)使用氦气脱气使用氦气脱气脱气机在线脱气脱气机在线脱气2425262728296050403020100mAU最后一次实验(30小时后)第一次实验182.3 2.3 四元泵的介绍四元泵的介绍特征特征/优点优点l四通路/低压混合能灵活地进行等度或梯度洗脱。l无需消耗昂贵的He而能进行高性能真空脱气。l自动冲程调节，混合非常均匀，降低基线噪音。l对于高盐流动相，可选择泵头密封垫清洗装置清洗密封垫。Agilent 1200系列四元泵前视图19溶剂柜溶剂柜真空脱气机真空脱气机 G1322A四元泵四元泵 G1311A泵体材料耐腐蚀泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，泵腔的体积要小，以便快速更换以便快速更换溶剂溶剂能在高压下连续能在高压下连续工作工作,耐压耐压40-40-50MPa.cm50MPa.cm2 2压力平稳，无压力平稳，无脉冲脉冲高压输液泵高压输液泵输出流量稳定，输出流量稳定，重复性高重复性高,输出输出流量范围宽流量范围宽泵头结构图211.宝石活塞杆2.活塞外框架(包括弹簧)3.支持环4.泵头密封垫5.泵腔6.入口主动阀7.出口单向阀8.塑料锁定螺栓9.冲洗阀10.泵头固定螺丝Agilent 1200 单元泵和四元泵的阀22PTFE Frit:01018-22707镀金密封垫镀金密封垫塑料出口盖塑料出口盖出口单向阀出口单向阀入口主动阀入口主动阀过滤芯耐过滤芯耐400bar5062-8562冲洗阀冲洗阀镀金密封垫镀金密封垫塑料出口盖塑料出口盖PTFE过滤芯过滤芯Agilent 溶剂传输系统串连柱塞泵23单向阀脉冲阻尼器减少了单向阀用量同样需要阻尼器（减少压力波动）可以使用压缩因子补偿四元泵工作原理示意图252.4 手动、自动进样器26标准自动进样器：标准自动进样器：G1329A标准自动进样器标准自动进样器SL型：型：G1329B高性能自动进样器：高性能自动进样器：G1367B高性能自动进样器高性能自动进样器SL型：型：G1367C高性能自动进样器高性能自动进样器SL+型：型：G1367D手动进样器：手动进样器：G1328B进样器基本原理六通阀27充样位置充样位置(Load)进样位置进样位置(Inject)至废液定量环（固定体积）来自泵至色谱柱进样针至色谱柱来自泵至废液手动进样器的实际流路连接图28充样位置充样位置进样位置进样位置1.样品环样品环6.废液废液5.放空管放空管4.样品环样品环3.色谱柱色谱柱2.接泵出口接泵出口废液管（孔废液管（孔5和和6）废液管末端与进样口水平废液管末端与进样口水平(Load)(Inject)Agilent 1200 系列标准自动进样器30 推荐推荐 l 进样体积从0.1L到100Ll 经过扩展，进样量可扩展至1800Ll 最多可容纳100个样品瓶l 自动样品前处理性能性能/优点优点l 进样体积重复性高(典型RSD 0.5%)l 进样动态范围宽 l 连续冲洗流路并有洗针功能降低样品残留l 所有驱动均采用电子驱动l 可以容纳不同规格的样品瓶l 灵活的进样程序编制可以进行样品前处理（例如柱前衍生）l 使用旁路可以降低延迟体积标准自动进样器进样过程31计量泵计量泵六通阀六通阀(旁路位置旁路位置)Bypass定量环定量环来自泵系统来自泵系统至废液口至废液口计量泵活塞杆回归零位计量泵活塞杆回归零位针座毛细管针座毛细管去往色谱柱去往色谱柱去往色谱柱去往色谱柱来自泵系统来自泵系统计量泵抽取样品计量泵抽取样品六通阀六通阀(旁路位置旁路位置)Bypass来自泵系统来自泵系统去往色谱柱去往色谱柱六通阀六通阀(主路位置主路位置)Mainpass1.六通阀切换到旁路位置六通阀切换到旁路位置2.计量泵活塞杆回归零位计量泵活塞杆回归零位3.抬起进样针抬起进样针 4.将样品抓至针座上将样品抓至针座上5.针扎入样品瓶针扎入样品瓶 6.计量泵抽取样品计量泵抽取样品7.针从样品瓶中拔出针从样品瓶中拔出8.将样品瓶放回样品盘将样品瓶放回样品盘9.针扎入针座毛细管针扎入针座毛细管10.六通阀切换到主路位置六通阀切换到主路位置Agilent 1200 系列标准自动进样器进样测试32min0 05 5101015152020252530303535mAU0 02020404060608080100100#1#1#10#10#5#5#8#8 10 L 样品，每次进样样品，每次进样 1 L，进样十次，进样十次Agilent 1200系列标准自动进样器特殊功能33l洗针功能洗针功能 把样品残留降低到最小限度把样品残留降低到最小限度l多次吸液多次吸液用于进样量大于用于进样量大于100L的情况的情况l程序进样程序进样 可以非常灵活地执行用户的进样程序要求可以非常灵活地执行用户的进样程序要求使用洗针功能可以降低样品残留34min510mAU04样品样品:0.01 mol/L 咖啡因咖啡因,普里米酮，非那西汀普里米酮，非那西汀进样量进样量:1L 洗针后的空白进样洗针后的空白进样(1L)不洗针后的空白进样不洗针后的空白进样(1L)样品残留峰样品残留峰洗针对样品残留的影响（清洗瓶盖帽/不盖帽）35样品残留(%)进样体积(L)00.050.10.150.20.250.30.350.10.515普里米酮普里米酮00.050.10.150.20.30.350.10.515非那西汀非那西汀0.25进样体积(L)样品残留(%)不洗针不洗针 洗针洗针(不盖瓶盖不盖瓶盖)洗针洗针(盖瓶盖盖瓶盖)2.5 Agilent 1200 柱温箱36特征特征/优点优点l大空间，可以容纳三根长色谱柱l更换柱子非常方便l降温非常方便l安装柱识别可以记录进样次数l使用切换阀可以进行柱切换(可选)l两个单独的加热区可以分别控制温度l可以进行程序升温l内部死体积小(左侧3L，右侧6L)推荐推荐.l温度控制范围：低于室温1080l保留时间的再现性需要稳定 的温度l如果需要在高于或低于室温 进行分离操作时，需要使用 柱温箱G1316A型柱温箱前视图37来自自动进样器来自自动进样器至流通池入口毛细管至流通池入口毛细管柱识别卡套柱识别卡套柱切换阀柱切换阀泄漏传感器泄漏传感器2.6 Agilent 1200 检测器38Agilent 1200系列检测器：系列检测器：可变波长检测器可变波长检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器示差折光检测器示差折光检测器荧光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器Agilent 1200 可变波长检测器（VWD）39推荐推荐 l产品开发及质量控制l应用需要高灵敏度检测器性能性能/优点优点.l从190600nm波长范围，噪音小，基线稳定(0.75x10-5 AU)*l可变波长检测，可以对不同物质的检测获取最大灵敏度。l更换氘灯及清洗检测池非常方便l内置钬玻璃可以非常快速方便地进行波长校准。l根据不同需要选择不同的流动池。可变波长检测器VWD前视图40流动池的后压非常重要，一定要使用流动池的后压非常重要，一定要使用适当的出口连接管。适当的出口连接管。氘灯氘灯流通池流通池VWD的氘灯41光学单元VWD光路图42氘灯氘灯光源透镜光源透镜滤光片（钬玻璃滤光片（钬玻璃/遮光）遮光）入射狭缝入射狭缝反射镜反射镜1 1反射镜反射镜2 2光栅光栅分光器分光器参比光电二极管参比光电二极管样品光电二极管样品光电二极管流通池流通池