液相色谱定量方法指导原则.pptx

液相色谱定性定量方法液相色谱定性定量方法1 有关色谱峰的基本概念（一）有关色谱峰的基本概念（一）峰底峰底(CD):峰的起点与终点之间连接的直线峰高峰高(h):峰最大值到峰底的距离峰宽峰宽(KL):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半高峰宽半高峰宽(W1/2):通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离峰面积（峰面积（A）:峰与峰底之间的面积,又称响应值拖尾峰（拖尾峰（Tailing peak）:后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰（前伸峰（Leading peak）:前沿较后沿平缓的不对称峰基线（基线（Baseline):在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线噪声（基线噪声（N）:由各种因素所引起的基线波动基线漂移基线漂移(Baseline drift):基线随时间定向的缓慢变化1 有关色谱峰的基本概念（二）有关色谱峰的基本概念（二）2 通过测量和计算得到的色谱参数（一通过测量和计算得到的色谱参数（一）死时间死时间(dead time，t0)不保留组分的保留时间，即流动相（溶剂）通 过色谱柱的时间。死体积死体积(dead volume，V0)由进样器进样口到检测器流动池未被固定 相所占据的空间。V0Ft0（F为流速）保留时间保留时间(retention time，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积保留体积(retention volume，VR)从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。VRFtR。调整保留时间调整保留时间(adjusted retention time，tR)扣除死时间后的保留时间。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质，因此tR（或tR）可用于定性。tRtRt0 调整保留体积调整保留体积(adjusted retention volume，VR)扣除死体积后的保留体积VRVRV0或VRFtR2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(二）二）柱效能柱效能：色谱柱在分离过程中主要有动力学参数决定的分离效能。通常用理论板数或有效板数表示。理论板数：若应用调整保留时间 tR计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(n有效或 neff)有效板数：2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(三）三）分分离离度度：两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与其平均峰宽之比表示。分离度图示分离度图示响应值：响应值：组分通过检测器系统产生的信号值。相对响应值：相对响应值：单位量物质与单位量参比物质的响应值之比。2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(四）四）校正因子（校正因子（f）：）：相对响应值的倒数，它与峰面积的乘积正比于物质的量。定量限（定量限（LOQ）：）：是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。2 通过测量和计算得到的色谱参数通过测量和计算得到的色谱参数(五）五）检测限（检测限（LODLOD）：）：系指试样中的被测物能被检查的最低量，是鉴别试验的灵敏度指标。其越低，反应的灵敏度越高。3 液相色谱的定性分析液相色谱的定性分析1、与已知物直接对照2、已知物峰高增加法3、二极管阵列检测器的三维图谱定性4、与其他仪器联用定性4 色谱法定量的依据色谱法定量的依据 在一定的操作条件下，检测器的响应信号（色谱峰的峰面积或峰高）与进入检测器组分的量成正比。即即：mi=fi Ai 或或 mifi hi式中：mi组分的量 fi比例常数这就是色谱法定量的依据。5 峰面积峰面积 A 的测量方法（一）的测量方法（一）（1）峰高）峰高 h 乘半峰宽乘半峰宽 w1/2 法法 将色谱峰视为等腰三角形，得到的面积为实际面积的0.94倍，故实际面积应为：（适合于对称峰）A 1.065 h w1/2（相对计算可略去前面系数）（2）峰高乘平均峰宽法）峰高乘平均峰宽法 不对称峰不能作前述近似，可于峰高0.15及0.85处测得峰宽，取其平均值进行计算：A=h(w0.15+w0.85)/25 峰面积峰面积 A 的测量方法（的测量方法（二）二）（3）峰高乘保留时间法）峰高乘保留时间法难以量度半峰宽的狭窄峰或半峰宽以上重叠的峰可用下式计算：A 1.065h b tR （相对计算可略去1.065和常数b）（4）剪纸称重法）剪纸称重法对于不对称或分离不完全的峰，可将峰剪下，以质量代其面积，使用较少。（5）自动积分法）自动积分法将记录仪与自动积分仪连接，可直接准确、快速地测出峰的面积。（6）以峰高代替峰面积定量法）以峰高代替峰面积定量法当各种实验条件严格保持不变时，一定进样范围内色谱峰的半峰宽不变，即可用峰高代替峰面积定量，特别对于狭窄的峰，较面积定量法更为准确。5 峰面积峰面积 A 的测量方法（的测量方法（三）三）6 定量校正因子（一）定量校正因子（一）检测器对不同物质的响应值不同，故相同质量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积不等，因而不能直接应用峰面积计算组分含量。为此引入“定量校正因子”以校正峰面积，使之能更真实地反映组分含量。前面已知：mi fi Ai 即：fi mi/Ai6 定量校正因子（二）定量校正因子（二）fi 称称绝绝对对校校正正因因子子，定定量量分分析析中中常常用用的的是是相相对对校校正正因因子子f i，定定义义为为组组分分的的绝绝对对校校正正因因子子与与标标准准物物质质的的绝绝对对校正因子之比：校正因子之比：v mi、ms用质量单位时，用质量单位时，f w称相对质量校正因子称相对质量校正因子v mi、ms用摩尔为单位时，用摩尔为单位时，f M称相对摩尔校正因子称相对摩尔校正因子v 注意：应用中一般地略去注意：应用中一般地略去“相对相对”两字两字6 质量校正因子的测定方法（三）质量校正因子的测定方法（三）准确称取一定量待测组分的纯物质和标准物质的纯物质混和后，取一定量（在检测器的线性范围内）在实验条件下注入色谱仪，出峰后分别测出两者峰面积，由前式可求得校正因子。7 常用的几种定量测定方法（一）常用的几种定量测定方法（一）（1）归一法 当试样中的全部组分都出峰（即都反映在色谱图上）时，可以从校正后每峰峰面积占全部色谱峰总面积的分数，求得该组分的质量分数。x i%=100 （可以为质量百分含量或摩尔百分含量）7 常用的几种定量测定方法（二）常用的几种定量测定方法（二）归一法的特殊情况若试样中各组分的相对校正因子很接近（如同系物中沸点接近的组分），上式则可简化为：x i%=100 当测量参数为峰高时，也可以用峰高归一法计算组分含量。（用峰高校正因子，以峰高代峰面积代入前页算式即可，）归一法具有简便、准确的特点归一法具有简便、准确的特点不足之处在于仅可使用于所有组分都出峰的情况不足之处在于仅可使用于所有组分都出峰的情况7 常用的几种定量测定方法（三）常用的几种定量测定方法（三）（2）内标法使用条件：试样中各组分不能全部出峰、各组分含量悬殊、仅需测定其中部分组分 操作步骤：a.准确称取一定量的试样；b.加入一定量的选定标准物（内标物）；c.混匀后进样，进行色谱分析；d.根据内标物和试样质量以及色谱图上相应的峰面积，计算待测组分的量。7 常用的几种定量测定方法（四）常用的几种定量测定方法（四）内标法待测组分含量计算式如下（由前可推得）:（各符号意义同上）内标法中常以内标物为基准，即：f s 1，也可用峰高代替峰面积，做法同上。内标法注意事项a.内标物应是试样中不存在的纯物质；b.加入的内标物量与试样中待测组分量相近；c.内标物的色谱峰应位于待测组分色谱峰附近或几个待测组分色谱峰之间。7 常用的几种定量测定方法（五）常用的几种定量测定方法（五）内标法优缺点优点：定量准确，对试样含有不出峰的组分情况下，也不影响测定。缺点：每次测定都必须准确称取样品和内标物质量，不适于快速分析。7 常用的几种定量测定方法（六）常用的几种定量测定方法（六）内标曲线法若以 Ci%对 Ai/As作图，则可得一条通过原点的直线内标标准曲线。为一常数，上式则可化为：x i%=用内标法待测组分含量计算式 若固定试样称取量，加入内标物也恒定，则有：7 常用的几种定量测定方法（七）常用的几种定量测定方法（七）内标标准曲线的绘制内标标准曲线的绘制a.将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液（系列）；b.取固定量的标准溶液和内标物，混合后进样分析，测出 Ai 和 As；c.用 Ai/As 对标准溶液浓度作图，可得一组通过原点的直线（内标标准曲线）。7 常用的几种定量测定方法（八常用的几种定量测定方法（八）样品测定与组分定量样品测定与组分定量a.称取与绘制标准曲线相同量的试样和内标物，测出其峰面积比，由标准曲线即可查出待测组分的含量。b.内标标准曲线法应用在生产过程控制分析上，不须计算校正因子，对液体样品也可量取体积，具有简便快速的特点。7 常用的几种定量测定方法（九）常用的几种定量测定方法（九）（3）外标标准曲线法a.取被测组分的纯物质，配制成一系列不同浓度的标准溶液；b.分别取一定体积上述溶液注入色谱柱；c.得到色谱图后测出峰面积或峰高；d.绘出峰面积（或峰高）对浓度的关系曲线（标准曲线）。标准曲线的绘制7 常用的几种定量测定方法（十）常用的几种定量测定方法（十外标法 样品测定（一）a.在同样操作条件下注入同样量（一般为体积）的待测试样，从色谱柱上测得峰面积或峰高，在标准曲线上即可查出待测组分的浓度。b.外标法也用于生产过程的控制分析，操作简便，计算简单，但分析结果准确性取决于操作条件的稳定性和进样的重现性。7 常用的几种定量测定方法（十一）常用的几种定量测定方法（十一）外标法 样品测定（二）c.当试样中待测组分浓度变化不大时，可不必作标准曲线，而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量接近的标准样，分别取相同量体积进样，测定标准样和待测样的峰面积，按下式计算组分含量:Ci%=Ai/As Cs%7 常用的几种定量测定方法（十二）常用的几种定量测定方法十二）（4）标准加入法（一）标准加入法实质上是一种特殊的内标法，以欲测组分的纯物质加入到待测样品中，分别测定加入前后的峰面积，从而计算欲测组分在样品中的含量。a.可以单点加入，色谱条件完全相同的情况下，按以下公式计算：7 常用的几种定量测定方法（十三）常用的几种定量测定方法（十三）标准加入法（二）b.可以加入一系列浓度，按标准曲线外推法计算出欲测物在样品中的含量。优点：不需要另外的内标物，不必要进样非常准确；操作简单；若在前处理过程加入，可补偿被测组分在处理过程中的损失。缺点：色谱条件要求完全一致，否则会带来分析误差。7 常用的几种定量测定方法（十四）常用的几种定量测定方法（十四）7 常用的几种定量测定方法（十五）常用的几种定量测定方法（十五）标准加入法（三）标准加入法标准曲线绘制 将一系列已知量待测物分别加入到几等份的样品中，配制成浓度为(cx+0),(cx+c1),(cx+c2),(cx+c3).和样品有相同基体的标准系列溶液(加标，spiking)；通过仪器分别测量以上系列溶液的响应值S0，S1，S2，S3，S4；以响应信号S对浓度c作图，再将直线外推与浓度轴相交于一点(下图)，求得样品中待测物浓度cx。cx0.00.20.0102030-10浓度，浓度，cSS2S3S4S10.40.60.81.01.2 当样品量很少时，可在一份样品中加标，加一次作一次测量，可得到上述当样品量很少时，可在一份样品中加标，加一次作一次测量，可得到上述 方法相同的结果；方法相同的结果；当觉得上述过程麻烦时，可只加标一次，分别测量样品和加标样品的仪器当觉得上述过程麻烦时，可只加标一次，分别测量样品和加标样品的仪器 响应，再直接通过公式进行计算。响应，再直接通过公式进行计算。优点优点：基体：基体(matrix)相近，或者说基体干扰相同；相近，或者说基体干扰相同；缺点缺点：麻烦，适于小数量的样品分析。：麻烦，适于小数量的样品分析。8 影响定量准确度的因素影响定量准确度的因素1、样品制备-衍生化成可气化的或有紫外吸收或带荧光的，转化率要高-溶剂-样品回收率-样品溶液的贮存2、进样技术-人员手动进样-进样装置的准确性3、色谱条件变化柱温（气相）、流动相组成（液相）；柱效对峰高有影响，峰面积无影响（保证分离度的情况下）4、检测器特性：线性范围和稳定性、特殊组分使用选择性检测器问题问题 几种重叠峰的切割（一）几种重叠峰的切割（一）问题问题 重叠峰切割和计算（二）重叠峰切割和计算（二）问题问题 重叠峰切割和计算（三重叠峰切割和计算（三）问题问题 重叠峰切割和计算（四）重叠峰切割和计算（四）问题问题 重叠峰切割和计算（五）重叠峰切割和计算（五）两峰等高误差最小，差距大，小峰误差大 谢谢！