淀粉酶紫外育种.pptx

实验二实验二淀粉酶产生菌紫外线诱变育种淀粉酶产生菌紫外线诱变育种1 1、掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤2 2、了解淀粉酶活力测定方法了解淀粉酶活力测定方法实验目的要求实验目的要求实实验验原原理理实实验验步步骤骤分三阶段进行分三阶段进行:诱变处理诱变处理观察诱变效应、观察诱变效应、接种、培养接种、培养-淀粉酶活力淀粉酶活力测定测定第一部分第一部分诱变处理诱变处理1）制备菌（芽孢）悬液；制备菌（芽孢）悬液；2）显微镜直接计数，调整细胞（芽孢）浓度至约显微镜直接计数，调整细胞（芽孢）浓度至约108/ml/；3）倒平板（牛肉膏蛋白胨；每组倒平板（牛肉膏蛋白胨；每组12套）；套）；4）紫外线处理（紫外线处理（3ml，直径，直径6cm平皿，平皿，15min）；）；5）稀释（至稀释（至105）；）；实验步骤(continued)实验步骤(continued)6)涂平板（取后涂平板（取后3个稀释度，每稀释度个稀释度，每稀释度2皿，每皿加菌液皿，每皿加菌液100ul）；）；注意：注意：4）6）在暗室红灯下进行）在暗室红灯下进行7)培养：平板倒置装于遮光袋，放置于培养：平板倒置装于遮光袋，放置于37培养培养48小时；小时；8)采用采用5）6）步同样方法稀释未经照射的菌液，并涂）步同样方法稀释未经照射的菌液，并涂平板（平板（6个），个），37培养培养48小时。小时。两天后进行第二阶段工作两天后进行第二阶段工作实验步骤(continued)第二部分：第二部分：观察诱变效应、接种、摇瓶培养观察诱变效应、接种、摇瓶培养 1111）接种、培养：）接种、培养：选取诱变组透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落（菌选取诱变组透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落（菌株）株）3个，分别接种牛肉膏蛋白胨液体培养基（每株接个，分别接种牛肉膏蛋白胨液体培养基（每株接1瓶），瓶），37，160rpm，培养，培养23天。天。9）分别计数诱变组和对照组平板上菌落数，并计算致死率；）分别计数诱变组和对照组平板上菌落数，并计算致死率；10）观察诱变效应：）观察诱变效应：加入碘液，分别测量诱变组和对照组加入碘液，分别测量诱变组和对照组1020个菌落的透明个菌落的透明圈直径和菌落直径，并计算比值，求平均数；将诱变组和对圈直径和菌落直径，并计算比值，求平均数；将诱变组和对照组数据作比较。照组数据作比较。实验步骤(continued)第三部分第三部分-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定（部颁标准）（部颁标准）1、原理、原理-淀粉酶能将淀粉分子键的淀粉酶能将淀粉分子键的-1-1，4 4葡萄糖苷键任意切断葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐渐消失，以该颜色消失的速淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。度计算酶的活力。实验步骤(continued)2 2、试剂、试剂 1 1、原原碘碘液液 称称取取碘碘5.5g5.5g，碘碘化化钾钾11g11g，先先用用少少量量蒸蒸馏馏水水使碘完全溶解后定容至使碘完全溶解后定容至250ml250ml，贮存于棕色瓶中。，贮存于棕色瓶中。2 2、稀稀碘碘液液 取取原原碘碘液液1ml1ml，加加入入碘碘化化钾钾10g10g，用用蒸蒸馏馏水水溶溶解解定容至定容至225ml225ml，贮于棕色瓶中。，贮于棕色瓶中。3 3、2%2%可可溶溶性性淀淀粉粉 精精确确称称取取2g2g可可溶溶性性淀淀粉粉（以以绝绝干干计计），然然后后用用少少量量蒸蒸馏馏水水调调匀匀，徐徐徐徐倾倾于于煮煮沸沸的的蒸蒸馏馏水水中中，加加热热煮煮沸沸至至透透明明为为止止，冷冷却却定定容容至至100ml100ml。（注注意意：此此溶溶液液需需当当天天配置）配置）实验步骤(continued)4 4、0.02mol/L pH6.00.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠（称取磷酸氢二钠（NaNa2 2HPOHPO4 4H H2 2O O）4.52g4.52g和柠檬酸和柠檬酸(C(C6 6H H8 8O O7 7H H2 2O)0.807g,O)0.807g,用蒸馏水溶解定容至用蒸馏水溶解定容至100ml100ml，配好后，配好后应以酸度计或精密试纸校正应以酸度计或精密试纸校正pHpH。5 5 5 5、标准终点色溶液、标准终点色溶液、标准终点色溶液、标准终点色溶液 A A液：精确称取氯化钴（液：精确称取氯化钴（CoClCoCl6H6H2 2O O）4.02439g4.02439g和重铬和重铬酸钾（酸钾（K K2 2CrCr2 2O O7 7）0.04878g0.04878g，以蒸馏水定容至，以蒸馏水定容至50ml50ml。B B液：精确称取铬黑液：精确称取铬黑T T（C C2020H H1212N N2 2NaONaO7 7S S）5mg,5mg,以蒸馏水溶以蒸馏水溶解定容至解定容至50ml50ml使用时取使用时取A A液液40ml40ml于于B B液液50ml50ml混合。此混合液宜冰箱保存，混合。此混合液宜冰箱保存，使用使用1515天后需要重新配制。天后需要重新配制。实验步骤(continued)3 3、操作步骤、操作步骤1)1)发酵液经发酵液经5000rpm5000rpm离心离心10min10min，取上清，作，取上清，作为供试酶液。为供试酶液。2)2)测定：测定：A)A)取取2ml2ml标标准准终终点点色色溶溶液液滴滴于于白白瓷瓷板板空空穴穴内内，作为比较颜色的标准。作为比较颜色的标准。B B）取取10ml 10ml 2%2%可可溶溶性性淀淀粉粉和和10ml 10ml pH6.0pH6.0磷磷酸酸氢氢二二钠钠-柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液，放放于于大大试试管管中中，在在6060恒恒温温水水浴浴中中预预热热4 45min5min。然然后后加加入入酶酶液液1ml1ml，立立即即记记录录时时间间，充充分分摇摇匀匀。定定时时用用滴滴管管取取反反应应液液约约0.5ml0.5ml，滴滴于于预预先先充充满满比比色色稀稀碘碘液液(约约1.5ml1.5ml）的的磁磁板板空空穴穴内内，当当穴穴内内颜颜色色反反应应由由紫紫色色逐逐渐渐变变为为红红棕棕色色，与与标标准准终终点点色色相相同同时时，即即为反应终点，并记录时间为反应终点，并记录时间t(min)t(min)。实验步骤(continued)4 4、计算酶活、计算酶活酶酶活活用用1ml1ml酶酶液液于于6060，pH6.0pH6.0的的条条件件下下，1h1h液液化化可可溶性淀粉的克数来表示溶性淀粉的克数来表示gg可溶性淀粉可溶性淀粉/ml/mlhh酶活力单位酶活力单位=60/t102%=60/t102%实验步骤(continued)实验结果实验结果实验报告实验报告1 1、实验原理、方法步骤、结果及分析、实验原理、方法步骤、结果及分析2、思考题、思考题1）为分离获得产蛋白酶的细菌，应从何种环为分离获得产蛋白酶的细菌，应从何种环境取样？境取样？2）如要分离淀粉酶产生菌，应如何设计培养）如要分离淀粉酶产生菌，应如何设计培养基？怎样识别目标菌？从何种环境取样？基？怎样识别目标菌？从何种环境取样？准准备：备：（配方见第三部分）（配方见第三部分）1）原碘液、稀碘液）原碘液、稀碘液（616-L1&616-R1）2）2%可溶性淀粉可溶性淀粉(616-L2&616-R2)3）0.02mol/L pH6.00.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 (619-L1&619-R1)(619-L1&619-R1)4 4）标准终点色溶液）标准终点色溶液 (619-L2&619-R2)(619-L2&619-R2)