激光共聚焦技术.pptx

Zeiss LSM 510 META激光共聚焦显微镜的基本结构激光共聚焦显微镜的基本结构激光光源激光光源 冷却系统冷却系统 扫描器扫描器 光学装置光学装置 荧光显微镜系统荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统图象存储与处理及控制系统针孔光栏针孔光栏 分光镜分光镜 发射荧光单色器发射荧光单色器 检测器检测器n n激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（LSMLSM）是当）是当）是当）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪今世界上最先进的分子生物学分析仪今世界上最先进的分子生物学分析仪今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。器之一。器之一。器之一。n n它是在荧光显微镜成像的基础上加装它是在荧光显微镜成像的基础上加装它是在荧光显微镜成像的基础上加装它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图了激光扫描装置，利用计算机进行图了激光扫描装置，利用计算机进行图了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光像处理，使用紫外光或激光激发荧光像处理，使用紫外光或激光激发荧光像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细探针，从而得到细胞或组织内部微细探针，从而得到细胞或组织内部微细探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变结构的荧光图像，观察细胞的形态变结构的荧光图像，观察细胞的形态变结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。化或生理功能的改变。化或生理功能的改变。化或生理功能的改变。n n成为形态学、分子细胞生物学、神经成为形态学、分子细胞生物学、神经成为形态学、分子细胞生物学、神经成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的科学、药理学和遗传学等领域中新的科学、药理学和遗传学等领域中新的科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。有力研究工具。有力研究工具。有力研究工具。激光共聚焦显微镜在生物学中的应用激光共聚焦显微镜在生物学中的应用原位鉴定细胞或组织内生原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构细胞形态结构l检测核酸检测核酸l检测蛋白质细胞定位检测蛋白质细胞定位l检测细胞凋亡检测细胞凋亡l细胞器的观察及测定细胞器的观察及测定l检测细胞融合检测细胞融合l观察细胞骨架观察细胞骨架l检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯l检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪活体细胞或组织功能的实活体细胞或组织功能的实时动态监测时动态监测l实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内Ca2+变变化化l测定细胞内测定细胞内pH变化变化l检测膜电位变化检测膜电位变化l检测细胞内活性氧物种的产检测细胞内活性氧物种的产生生l检测药物等跨膜进入组织或检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位细胞过程及其定位l检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移l检测荧光漂白恢复检测荧光漂白恢复荧光显微镜系统荧光显微镜系统激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。l需与需与扫描器扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照连接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。l需有需有光路转换光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时装置。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。汞灯光线强度可调。l荧光镜座要有荧光镜座要有防震动防震动装置。装置。激光共聚焦显微镜工作原理示意图激光共聚焦显微镜工作原理示意图激光经放大、激光经放大、分光后由物镜分光后由物镜聚焦于焦平面聚焦于焦平面上，同时，焦上，同时，焦平面上被激光平面上被激光扫描的点扫描的点F所发所发出出的一定波长的一定波长的荧的荧光通过检光通过检测针孔测针孔光栏达光栏达到检测器，到检测器，并并成像于显示器成像于显示器上，得到相应上，得到相应的荧光图象。的荧光图象。激光共聚焦显微镜基本操作l获取共焦图像的步骤获取共焦图像的步骤l在在 VIS 模式中观察样品模式中观察样品l装入装入 LSM 配置配置l扫描图像扫描图像l保存图像保存图像不同厚度光切图像不同厚度光切图像 Z轴扫描轴扫描 时间系列扫描时间系列扫描 Z轴扫描时间系列扫描轴扫描时间系列扫描Z轴扫描、时间系列扫描轴扫描、时间系列扫描组织和细胞样品中荧光的来源组织和细胞样品中荧光的来源l自发荧光自发荧光l荧光染色荧光染色l免疫荧光荧光抗体法产生荧光免疫荧光荧光抗体法产生荧光l外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光l酶致荧光酶致荧光荧光样品的制备要求荧光样品的制备要求l荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确l保持样品应有的结构形态完整性保持样品应有的结构形态完整性l荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性l荧光强度适宜荧光强度适宜l荧光稳定性好荧光稳定性好l样品的荧光分布均匀样品的荧光分布均匀l两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除可以消除l图象背景干净、干扰杂质少图象背景干净、干扰杂质少荧光探针的种类及应用荧光探针的种类及应用l原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构细胞形态结构检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、YFP等）等）l活体细胞或组织功能的实时动态监测活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内Ca2+变化：变化：fluo-3/AM，fura-2荧光探针标记样品的过程荧光探针标记样品的过程l样品预处理样品预处理l给药、切片或细胞标本的制备给药、切片或细胞标本的制备l荧光探针标记样品荧光探针标记样品百合花粉管钙离子浓度梯度检测o液体培养基中培养百合花粉o观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径的25倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观察。荧光探针oFluo-3（/AM）n属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。nFluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物，fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。n游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与Ca2结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内Ca2呈正相关，因此可以得到Ca2浓度。n另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙也有作用。save “projection”Projection图图710.7.连续降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示冬小麦胞内荧光有相同的变化趋势。8.连续降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示春小麦胞内荧光有相同的变化趋势。9.Fluo-3/AM染色后,静息态下冬小麦原生质体的三维重组图像。10.Fluo-3/AM染色后,静息态下春小麦原生质体的三维重组图像。刘炜等，低温处理对冬、春小麦细胞Ca2+时空变化的影响，植物学报，2001，43(12):1218 1223目的蛋白细胞器定位观察n含有荧光蛋白的载体pA7-GFPn目的基因n洋葱表皮XbaI,SmaI,BamHI目的蛋白细胞器定位观察n含有荧光蛋白的载体pA7-GFPCaMV 35S PromoterXhoI,NcoI,SalI,SpeIGFPn目的基因目的蛋白细胞器定位观察对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的片段。根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段已经和质粒DNA重组。图图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定鉴定酶切：重组质粒酶切产物；酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒：重组质粒PCR产物产物目的蛋白细胞器定位观察含含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体瞬时表达载体以及pA7-GFP载体载体约20 L分别加入1.5 mL离心管中，分别加入500 L的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。(2)分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。(3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。(4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。(5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。(6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水培养16小时。目的蛋白细胞器定位观察 Bright GFP Merged TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；A、D：透射光下的表皮细胞；：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞35S:GFP a b c35S:BrTTG1-GFPdef