激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中应用.pptx

L Laser aser S ScanningcanningC Confocal onfocal MMicroscopeicroscope激光扫描共聚焦显微镜LSCM在生命科学中应用1 1、显微形态学常用工具、显微形态学常用工具电子显微镜光学显微镜TEM SEM生物显微镜生物显微镜 荧光显微镜荧光显微镜 实体镜实体镜LSCM2 2、LSCMLSCM简介简介A.特点特点用激光作为光源，分辨率高，对样品损伤小，活体观察。用激光作为光源，分辨率高，对样品损伤小，活体观察。对样品做光学切片，具有对样品做光学切片，具有Z轴分辨率。轴分辨率。以样品产生的荧光为检测信号，可进行定性、以样品产生的荧光为检测信号，可进行定性、定量测量。定量测量。计算机重构形成立体图像。计算机重构形成立体图像。监测时间空间动态变化。监测时间空间动态变化。超出单纯形态学观察。超出单纯形态学观察。B.光路光路物镜标本针针 孔孔有针孔无针孔C.成像原理成像原理ABBCCCABA3 3、功能介绍、功能介绍具有普通光镜所有的功能具有普通光镜所有的功能:万能生物显微镜、荧光显微镜、微分干涉万能生物显微镜、荧光显微镜、微分干涉A.A.多通道、多荧光成像多通道、多荧光成像B.B.光学切片，重构三维显微图像光学切片，重构三维显微图像C.C.生物活性物质生物活性物质（蛋白质、核酸、离子）（蛋白质、核酸、离子）定性、定量、定位分析定性、定量、定位分析D.D.生理生化指标生理生化指标（pHpH、CaCa2+2+、MgMg2+等等）的动态观察、测量的动态观察、测量E.E.荧光漂白后恢复技术荧光漂白后恢复技术F.F.细胞的激光显微细胞的激光显微“外科手术外科手术”及光陷阱技术及光陷阱技术G.G.药物、病毒、细菌等外界物质的跟踪药物、病毒、细菌等外界物质的跟踪 H.H.荧荧光蛋白的应用光蛋白的应用 I.I.强大的图像处理功能。强大的图像处理功能。利用利用LSCM还可以研究：细胞凋亡、细胞增值的动态过程；膜流还可以研究：细胞凋亡、细胞增值的动态过程；膜流动性、通透性、膜电位变化的检测；各种递质、高分子物质的扩散、动性、通透性、膜电位变化的检测；各种递质、高分子物质的扩散、受体的移动变化；细胞骨架、基因定位、原位杂交受体的移动变化；细胞骨架、基因定位、原位杂交.A.A.多荧多荧光图像光图像 用多荧光，您可以使用多个标记同时研究细胞结构。此外，多荧光试验是直接研究分子和其他细胞成分之间关系的唯一工具。三重荧光图像与透射光图像三重荧光图像与透射光图像多通道成像原理Ch-1DAPICh-2FICTCh-3TRITC=B.B.光学切片与重构三维图像光学切片与重构三维图像C.C.生物活性物质定性、定量、定位监测生物活性物质定性、定量、定位监测D.D.生理生化指标的动态观察生理生化指标的动态观察Cover Glass:170umAir/Oil/WaterFor InvertedE.E.荧光漂白后恢复荧光漂白后恢复 研究膜或活细胞内用荧光标记的分子的扩散、转移或其他类型的运动 F.F.细胞的激光细胞的激光 “外科手术外科手术”及光陷阱技及光陷阱技术术 将激光作为将激光作为光子刀光子刀，完成诸如细胞膜，完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体溶酶体等细胞器、染瞬间穿孔、切除线粒体溶酶体等细胞器、染色体切割、切除神经元突起等。色体切割、切除神经元突起等。通过光陷阱操作可移动细胞器的微小颗通过光陷阱操作可移动细胞器的微小颗粒和结构，广泛应用于染色体、细胞器、细粒和结构，广泛应用于染色体、细胞器、细胞骨架的移动。胞骨架的移动。在细胞培养时还可以作细胞筛选在细胞培养时还可以作细胞筛选G.G.药物、病毒、细菌的跟踪、定位药物、病毒、细菌的跟踪、定位 利用自发荧光或进行荧光标记，还可以利用自发荧光或进行荧光标记，还可以检测该物质在细胞的分布及进入细胞的动检测该物质在细胞的分布及进入细胞的动态过程。态过程。H.H.荧光蛋白的应用荧光蛋白的应用GFP:238个氨基酸，分个氨基酸，分子量小，子量小，479激发，激发，509发射，其融合的蛋白不发射，其融合的蛋白不影响结合蛋白的生物活影响结合蛋白的生物活性，转染的细胞可继续性，转染的细胞可继续传代。所以传代。所以GFP基因可基因可以作为一种直观、方便、以作为一种直观、方便、有效的报告基因。直接有效的报告基因。直接观察蛋白质定位、监测观察蛋白质定位、监测基因转录变化。基因转录变化。I.I.笼锁笼锁解笼锁解笼锁 许多重要生物活性物质都有其笼锁化合物，处于笼锁状许多重要生物活性物质都有其笼锁化合物，处于笼锁状态其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活态其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，恢复原有生物功能。化解笼锁，恢复原有生物功能。通过通过LSCM人为控制多种生物活性产物和其他化合物在人为控制多种生物活性产物和其他化合物在生理过程中发挥功能的时间和空间。生理过程中发挥功能的时间和空间。活性蛋白酶活性蛋白酶反式肉桂酰反式肉桂酰活性部位酯化活性部位酯化无活性酰基酶无活性酰基酶 光作用光作用 解笼锁解笼锁顺式顺式有活性有活性J.J.强大的图像处理功能强大的图像处理功能图像的加、减、乘、除、比率运算图像的加、减、乘、除、比率运算长度、面积、角度测量长度、面积、角度测量任意空间角度下的三维切面任意空间角度下的三维切面4.4.应用思路应用思路动植物组织冰冻切片1005um自发荧光或荧光染色自发荧光或荧光染色 培养的细胞、组织培养的细胞、组织荧光染色加入处理醛类长期固定样品醛类长期固定样品冰冻切片1005um蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗3次次LSCM观察观察5.5.应用实例应用实例A.实时测量细胞内实时测量细胞内Ca2+浓度的变化：浓度的变化：贴壁生长贴壁生长的细胞的细胞缓冲液洗缓冲液洗去杂质去杂质Fluo-3荧光染色荧光染色37孵育孵育30min缓冲液洗脱未结缓冲液洗脱未结合染料合染料 10min488激发激发525检测检测加入药物等加入药物等研研究因子研研究因子时间序时间序列扫描列扫描细胞内细胞内Ca 2+浓度估算浓度估算图像存储图像存储图像分析图像分析6 6、LSCMLSCM的产生的产生1957年开始提出共聚焦显微镜技术原理。年开始提出共聚焦显微镜技术原理。LSCM作为商品仪器是在作为商品仪器是在80年代初。年代初。真正具有强大功能、完善的光学系统、计算机真正具有强大功能、完善的光学系统、计算机控制的控制的LSCM从从1997开始形成。开始形成。7.7.我们的仪器配置我们的仪器配置 我校新购置蔡司我校新购置蔡司510510配备配备458458、477477、488488、543543、633633六条可六条可见激光三个共聚焦通道。能满足绝见激光三个共聚焦通道。能满足绝大多数荧光染料的要求。大多数荧光染料的要求。谢谢您的参与!希望大家交流、指正！希望大家交流、指正！于维军于维军405nm 0.5s405nm 0.25sphoto bleachingphoto bleaching