细胞电生理研究进展.pptx

细胞电生理研究进展细胞电生理研究进展一 电压钳（voltage clamp）技术 20世纪世纪50年代，年代，Hodgkin and Huxley 首次应用首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定。电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定。l 在在在在枪乌贼枪乌贼枪乌贼枪乌贼大纤维内纵向插入大纤维内纵向插入大纤维内纵向插入大纤维内纵向插入两根细铂丝两根细铂丝两根细铂丝两根细铂丝，一，一，一，一根记录根记录根记录根记录电压电压电压电压E E E E，另一根记录，另一根记录，另一根记录，另一根记录电流电流电流电流I I I I。记录膜电位。记录膜电位。记录膜电位。记录膜电位E E E E与与与与调定电压差值经放大进入快速电压调定电压差值经放大进入快速电压调定电压差值经放大进入快速电压调定电压差值经放大进入快速电压-电流转换器电流转换器电流转换器电流转换器(FBA),(FBA),(FBA),(FBA),加入加入加入加入反馈电流反馈电流反馈电流反馈电流I I I I,直至膜电位与调定电压直至膜电位与调定电压直至膜电位与调定电压直至膜电位与调定电压相等为止相等为止相等为止相等为止,维持膜电压不变。维持膜电压不变。维持膜电压不变。维持膜电压不变。l l 当一个当一个当一个当一个神经冲动神经冲动神经冲动神经冲动到达时，出现到达时，出现到达时，出现到达时，出现膜离子电流膜离子电流膜离子电流膜离子电流，为了为了为了为了维持膜电位不变维持膜电位不变维持膜电位不变维持膜电位不变，就必须输入一个与膜离子，就必须输入一个与膜离子，就必须输入一个与膜离子，就必须输入一个与膜离子电流大小相等，方向相反的电流大小相等，方向相反的电流大小相等，方向相反的电流大小相等，方向相反的补偿电流补偿电流补偿电流补偿电流,记录下这个记录下这个记录下这个记录下这个补偿电流就是补偿电流就是补偿电流就是补偿电流就是膜电流的镜像膜电流的镜像膜电流的镜像膜电流的镜像。工作原理：工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后电生理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。子电流（大小相等方向相反）。意义意义：1）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平（不变）；指令电位的水平（不变）；2）通过电流检测装置，记录到补充）通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可测入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电导及功定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电导及功能活动。能活动。（一）电压钳 基本原理离子通道电流:细胞膜上的电流 膜电容充放电电流 电压钳技术消除膜电容电流的影响 电压钳技术的基本原理：用微电极将膜电压钳制到新的数值上，保持一段时间不变使膜电容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期，测得的跨膜电流可以认为来自于离子通道电流。（二）理想的电压钳（二）理想的电压钳存在问题：没有考虑钳制电压的微电极阻抗RCE（兆欧姆数量级）若考虑微电极电阻，钳制电压VC就就被分压，并且，膜电阻Rm 可以有大幅度改变，（三）双电极电压钳（三）双电极电压钳 加记录电极实现闭环电路的反馈控制加记录电极实现闭环电路的反馈控制加记录电极实现闭环电路的反馈控制加记录电极实现闭环电路的反馈控制 A1和和A2为两个高增益的运算放大器，为两个高增益的运算放大器，A1连接成电压跟随器提供连接成电压跟随器，提供 高输入阻抗和低输出阻抗；高输入阻抗和低输出阻抗；A2连接成负反馈放大器。连接成负反馈放大器。（四）单电极电压钳（四）单电极电压钳 在电压钳制的稳态期，钳制电压在电压钳制的稳态期，钳制电压V VC C=V=Vmm(R(Rmm R RCECE)/R)/Rmm 只有当钳制电极的电阻只有当钳制电极的电阻R RCECE远小于细胞膜电阻远小于细胞膜电阻R Rmm时，时，V VmmVVC C二、膜片钳实验技术二、膜片钳实验技术 膜片钳技术是细胞生物学研究的一个重大发明。由德国神经生物学家赫尼（Neher）和萨克曼（Sakmann）在1970s年代中期发明，1991年两人共同荣获诺贝尔生理学和医学奖。NeherSakmann（一）膜片钳技术发展历史 19761976年德国马普生物物理化学研究所年德国马普生物物理化学研究所NeherNeher和和SakmannSakmann首次首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到AChACh激激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。19801980年年SigworthSigworth等在记录电极内施加等在记录电极内施加5-50 cmH5-50 cmH2 2O O的负压吸的负压吸引，得到引，得到10-100G10-100G的高阻封接（的高阻封接（Giga-sealGiga-seal），大大降低了记），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。流的突破。19811981年年HamillHamill和和NeherNeher等对该技术进行了改进，引进了膜等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有有1pA1pA的电流灵敏度、的电流灵敏度、1m1m的空间分辨率和的空间分辨率和10s10s的时间分辨率。的时间分辨率。19831983年年1010月，月，Single-Channel RecordingSingle-Channel Recording一书问世，奠定一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。了膜片钳技术的里程碑。Sakmann Sakmann 和和NeherNeher也因其杰出的工作也因其杰出的工作和突出贡献，荣获和突出贡献，荣获19911991年诺贝尔医学和生理学奖。年诺贝尔医学和生理学奖。（二）膜片钳技术的原理 同电压钳，同电压钳，同电压钳，同电压钳，用特制的玻璃微吸管吸附于用特制的玻璃微吸管吸附于用特制的玻璃微吸管吸附于用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面,使之形成使之形成使之形成使之形成10101010100100100100的密封的密封的密封的密封(giga-seal)(giga-seal)(giga-seal)(giga-seal)，被孤立的小膜片面积为，被孤立的小膜片面积为，被孤立的小膜片面积为，被孤立的小膜片面积为mmmm量级量级量级量级,内中仅有少数离子通道。使与内中仅有少数离子通道。使与内中仅有少数离子通道。使与内中仅有少数离子通道。使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域电极尖开口处相接的细胞膜的小区域电极尖开口处相接的细胞膜的小区域电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，然后（膜片）与其周围在电学上绝缘，然后（膜片）与其周围在电学上绝缘，然后（膜片）与其周围在电学上绝缘，然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离对该膜片实行电压钳位，可测量单个离对该膜片实行电压钳位，可测量单个离对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的子通道开放产生的子通道开放产生的子通道开放产生的pApApApA（10101010安培）量级的安培）量级的安培）量级的安培）量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。电流，这种通道开放是一种随机过程。电流，这种通道开放是一种随机过程。电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变通过观测单个通道开放和关闭的电流变通过观测单个通道开放和关闭的电流变通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电化，可直接得到各种离子通道开放的电化，可直接得到各种离子通道开放的电化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布流幅值分布、开放几率、开放寿命分布流幅值分布、开放几率、开放寿命分布流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离等功能参量，并分析它们与膜电位、离等功能参量，并分析它们与膜电位、离等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、研究。这种技术对小细胞的电压钳位、研究。这种技术对小细胞的电压钳位、研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很改变膜内外溶液成分以及施加药物都很改变膜内外溶液成分以及施加药物都很改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。方便。方便。方便。（一）膜片钳技术的原理 1 显微照片2 单个离子通道电流3 多个离子通道电流的叠加。双电极电压钳技术低电阻P2、高增益A2时，VmVc 对细胞有损伤，不宜于小细胞 单电极电压钳技术（膜片钳）电极电阻远小于膜片电阻，A1高增益，A2单位增益（检测），运算放大器的正负输入端子为等电位，向正输入端子施加指令电位、经过短路负端子可以使膜片等电位，达到电位钳制的目的。当膜片微电极尖端与膜片之间形成10G欧（以上封接时其间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流（I）可100做为来自膜片电极的记录电流（Ip）而被测量出来。RsealIpIIpRfR0R0是与膜片阻抗相串联的局部串联电阻（或称输入阻抗）。R0通常为1-5 M欧，如果Rseal高达 10G欧，此时Ip/I=Rseal/(R0+Rseal).此时Ip可作为在IV转换器(点线）内的高阻抗反馈电阻（Rf）的电压降而被检测出。实际上这时场效应管运算放大器A1的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在第二级场效应管运算放大器A2时被减掉。RsealIpIIpRfR0(二二)膜片钳电极的制备膜片钳电极的制备n n1.标本制备根据研究目的的不同，可采标本制备根据研究目的的不同，可采用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞，胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞，必须满足实验要求，一般多采用酶解分离必须满足实验要求，一般多采用酶解分离法，也可采用细胞培养法；另外，由于与法，也可采用细胞培养法；另外，由于与分子生物学技术的结合，现在也运用分子分子生物学技术的结合，现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道，如利用非克隆技术表达不同的离子通道，如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。n n2.电极制备合格的膜片微电极是成功封电极制备合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。软玻璃电极常用于作全细胞记录，璃）。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。子单通道记录。电极玻璃3.电极在实验前要电极在实验前要灌注电极液，由于电极尖，由于电极尖端较细，因此在充灌前，电极内液要用端较细，因此在充灌前，电极内液要用0.2 m的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖尖(tipfilling)和后充和后充(backfilling)两步。灌尖两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细即可，由于毛细作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为般为25M，而全细胞记录则最好在，而全细胞记录则最好在23M。4.进行实验，记录和分析数据准备工作就进行实验，记录和分析数据准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析绪后即可进行实验操作，数据记录和分析膜片钳实验技术的新发展膜片钳实验技术的新发展 传统膜片钳技术主要优缺点总结传统膜片钳技术主要优缺点总结 优优优优 点点点点缺缺缺缺 点点点点A A高信息量高信息量高信息量高信息量:能改变细胞膜电位能改变细胞膜电位能改变细胞膜电位能改变细胞膜电位,单细胞记单细胞记单细胞记单细胞记录录录录A A需要受过良好训练的电生理学需要受过良好训练的电生理学需要受过良好训练的电生理学需要受过良好训练的电生理学专家专家专家专家B B高灵敏性高灵敏性高灵敏性高灵敏性:能记录到能记录到能记录到能记录到pApA级电流变化和单级电流变化和单级电流变化和单级电流变化和单通道开关状态通道开关状态通道开关状态通道开关状态B B通量很低通量很低通量很低通量很低,一天的实验数据量不一天的实验数据量不一天的实验数据量不一天的实验数据量不超过超过超过超过1010C C灵活性好灵活性好灵活性好灵活性好:可以控制改变细胞膜内外的溶可以控制改变细胞膜内外的溶可以控制改变细胞膜内外的溶可以控制改变细胞膜内外的溶液成分液成分液成分液成分C C劳动力投入密集劳动力投入密集劳动力投入密集劳动力投入密集,试验操作过程试验操作过程试验操作过程试验操作过程复杂复杂复杂复杂D D应用范围广应用范围广应用范围广应用范围广:可以分析检测所有的离子通可以分析检测所有的离子通可以分析检测所有的离子通可以分析检测所有的离子通道类型道类型道类型道类型D D不适合药物粗筛不适合药物粗筛不适合药物粗筛不适合药物粗筛/二次筛选二次筛选二次筛选二次筛选E E相对于荧光标记和放射性标记等手段具相对于荧光标记和放射性标记等手段具相对于荧光标记和放射性标记等手段具相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性有更高权威性和精确性有更高权威性和精确性有更高权威性和精确性E E技术自动化非常困难技术自动化非常困难技术自动化非常困难技术自动化非常困难,且不能进且不能进且不能进且不能进行平行检测行平行检测行平行检测行平行检测膜片钳实验技术的新发展膜片钳实验技术的新发展n n目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！膜片钳实验技术的新发展膜片钳实验技术的新发展1.Flip-Tip1Flip-Tip翻转技术：翻转技术：翻转技术：翻转技术：将一定密度的细胞悬液灌将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后膜形成全细胞模式。随后,药物药物化合物等可以被自动应用到管化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种内进行全细胞模式实验。这种方式形成的膜片钳完全排除显方式形成的膜片钳完全排除显微镜和显微操作微镜和显微操作从而革命性的从而革命性的实现膜片钳技术的全自动化。实现膜片钳技术的全自动化。它的显著特点是仍然采用玻璃它的显著特点是仍然采用玻璃毛坯作为电极。毛坯作为电极。2.SealChip技术：技术：完全摒弃了玻璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2m的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。3.Population Patch 3.Population Patch ClampClamp（PPCPPC）技术：）技术：）技术：）技术：同同SealChipSealChip技术一样，技术一样，完全摒弃了玻璃电极，而完全摒弃了玻璃电极，而是采用是采用PatchPlatePatchPlate平面电极平面电极芯片。该芯片含有多个小芯片。该芯片含有多个小室，每个小室中含有很多室，每个小室中含有很多1-2m1-2m的封接孔。在记录时，的封接孔。在记录时，每个小室中封接成功的细每个小室中封接成功的细胞数目较多，获得的记录胞数目较多，获得的记录是这些细胞通道电流的平是这些细胞通道电流的平均值。均值。总而言之总而言之,全自动膜片钳技术具有如下的优点全自动膜片钳技术具有如下的优点:效率高效率高,是传统膜片钳效率的是传统膜片钳效率的2020300300倍倍;不需要专不需要专业电生理人员业电生理人员,简单易用简单易用,所有的操作可以在电脑软所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成件控制的界面下完成,无须显微防震系统无须显微防震系统;大部分仪大部分仪器的封接质量在器的封接质量在1G1G以上以上;部分仪器同时适用于研部分仪器同时适用于研究配体门控通道和电压门控通道究配体门控通道和电压门控通道;主要应用于药物主要应用于药物药理和毒理测试药理和毒理测试;在药物微量加样设计方面表现优在药物微量加样设计方面表现优秀秀;仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。缺点缺点:仪器仅适用于悬浮细胞实验。仪器仅适用于悬浮细胞实验。无疑地无疑地,随着基因组随着基因组测序的完成和蛋白质组学的兴起测序的完成和蛋白质组学的兴起,离子通道在未来离子通道在未来的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与此同时此同时,作为离子通道研究的最佳伴侣作为离子通道研究的最佳伴侣-全自动膜全自动膜片钳片钳,由于其独特的优点也必定在这一领域大展身由于其独特的优点也必定在这一领域大展身手。手。3离子通道3.1 重要的生理功能细胞生物电现象的基础参与维持细胞正常形态细胞兴奋-收缩偶联和兴奋-分泌偶联细胞跨膜信号转导3.1 3.1 重要的生理功能重要的生理功能n n细胞生物电现象的基础细胞生物电现象的基础静息电位的形成静息电位的形成细胞生物电现象的基础动作电位的形成n n参与维持细胞正常形态n n细胞兴奋细胞兴奋-收缩偶联收缩偶联n n细胞兴奋细胞兴奋-分泌分泌-兴奋偶联兴奋偶联n n细胞跨膜信号转导3.2离子通道分类分类方法分类方法分类方法分类方法具体类别具体类别具体类别具体类别电电电电压压压压门门门门控控控控性性性性，voltage voltage voltage voltage gatedgatedgatedgated又又 称称 电电 压压 依依 赖赖 性性(voltage(voltage dependent)dependent)或或 电电 压压 敏敏 感感 性性(voltage(voltage sensitive)sensitive)离离子子通通道道:因因膜膜电电位位变变化化而而开开启启和和关关闭闭，以以最最容容易易通通过过的的离离子子命命名名，如如K+K+、Na+Na+、Ca2+Ca2+、Cl-Cl-通通道道4 4种种主要类型，各型又分若干亚型主要类型，各型又分若干亚型.配配配配体体体体门门门门控控控控性性性性，ligand gatedligand gatedligand gatedligand gated又又称称化化学学门门控控性性(chemical(chemical gated)gated)离离子子通通道道，由由递递质质与与通通道道蛋蛋白白质质受受体体分分子子上上的的结结合合位位点点结结合合而而开开启启，以以递递质质受受体体命命名名，如如乙乙酰酰胆胆碱碱受受体体通通道道、谷谷氨氨酸酸受受体体通通道道、门门冬冬氨氨酸酸受受体体通通道道等等.非非选选择择性性阳阳离离子子通通道道(non-selective(non-selective cation cation channels)channels)系系由由配配体体作作用用于于相相应应受受体体而而开开放放，同同时时允允许许Na+Na+、Ca2+Ca2+或或K+K+通过，属于该类通过，属于该类.机机机机械械械械门门门门控控控控性性性性，mechanogatedmechanogatedmechanogatedmechanogated又又称称机机械械敏敏感感性性(mechanosensitive)(mechanosensitive)离离子子通通道道:是是一一类类感感受受细细胞胞膜膜表表面面应应力力变变化化，实实现现胞胞外外机机械械信信号号向向胞胞内内转转导导的的通通道道，根根据据通通透透性性分分为为离离子子选选择择性性和和非非离离子子选选择择性性通通道道，根根据据功功能能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道作用分为张力激活型和张力失活型离子通道.基因相似性基因相似性基因相似性基因相似性根根据据基基因因序序列列的的相相似似性性或或同同源源性性而而归归类类的的离离子子通通道道，例例如如TRPTRP家族等。家族等。在1902年，BernsteinBernsteinBernsteinBernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性，即细细细细胞静息电位的钾离子学说胞静息电位的钾离子学说胞静息电位的钾离子学说胞静息电位的钾离子学说；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。HodgkinHodgkin、HuxleyHuxley、KatzKatz等人在20世纪3050年代做出了开创性研究。他们基于电压钳技术，提出并验证了所谓的HodgkinHuxley方程，数学模拟出和真实状况相符合的神经冲动的传导，由此建立了细胞动作电位的钠离子学说细胞动作电位的钠离子学说细胞动作电位的钠离子学说细胞动作电位的钠离子学说。离子通道的近代观念也由此产生。3.33.3离子通道研究理论离子通道研究理论3.4离子通道研究技术1.1.微电极电压钳微电极电压钳-电流钳技术电流钳技术2.2.传统膜片钳技术传统膜片钳技术ErwinNeher(1944-)KennethCole(1900-1984)3.3.平板膜片钳技术（膜片钳技术新趋势的关键）平板膜片钳技术（膜片钳技术新趋势的关键）原创技术专利：原创技术专利：原创技术专利：原创技术专利：表表2.膜片钳技术的历史角色膜片钳技术的历史角色年份年份电生理学中标志性事件电生理学中标志性事件17861786Luigi Galvani Luigi Galvani 首次在蛙类体内发现生物电现象，电生理学的创始人，首次在蛙类体内发现生物电现象，电生理学的创始人，18871887Sidney Ringer Sidney Ringer 发明了蛙心灌流试验用的溶液。发明了蛙心灌流试验用的溶液。18881888Walther Nernst Walther Nernst 提出了提出了Nernst Nernst 方程。方程。19021902Julius Bemstein Julius Bemstein 提出静息电位的提出静息电位的K+K+学说。学说。19371937Renshaw Renshaw 首次使用微电极成功记录到了脊髓中间神经元的电活动。首次使用微电极成功记录到了脊髓中间神经元的电活动。19461946GerardGerard首次使用微电极测定了蛙肌细胞膜电位。首次使用微电极测定了蛙肌细胞膜电位。19491949LingLing发明了微电极细胞内记录技术，发明了微电极细胞内记录技术，ColeCole首创的首创的电压钳技术电压钳技术电压钳技术电压钳技术问世，成为电生理学史上问世，成为电生理学史上重要的里程碑，电生理研究进入重要的里程碑，电生理研究进入细胞时代细胞时代细胞时代细胞时代。19491949HodgkinHodgkin和和KatzKatz提出了动作电位提出了动作电位Na+Na+学说。学说。19521952HodgkinHodgkin和和HuxleyHuxley分离出分离出Na+Na+、K+K+电流和漏电流。电流和漏电流。19531953FattFatt和和KatzKatz分离出了分离出了Ca2+Ca2+电流。电流。19641964DeckDeck、KernKern和和TrantweinTrantwein在浦肯野氏纤维上进行电压钳研究。在浦肯野氏纤维上进行电压钳研究。19761976E.NeherE.Neher和和B.SakmannB.Sakmann创立了创立了膜片钳技术膜片钳技术膜片钳技术膜片钳技术，使电生理研究空前活跃，并作为重要的里程，使电生理研究空前活跃，并作为重要的里程碑，标志着电生理碑，标志着电生理分子时代分子时代分子时代分子时代的到来。的到来。19801980膜片钳技术、生物大分子技术以及生物光学技术的结合，使人们对生物电现象的认识水膜片钳技术、生物大分子技术以及生物光学技术的结合，使人们对生物电现象的认识水平在分子水平取得了重大的突破和丰富。平在分子水平取得了重大的突破和丰富。3.5传统膜片钳设备的组成电学部分电学部分 信号放大器 数据采集卡 PC 周边设备控制器等光学部分光学部分：荧光显微镜 CCD照相机 监视器 激光器等 机械部分机械部分 防震台，气压泵或气瓶 高精密微电极操作器 灌流操作器 显微镜移动平台或可移动载物台辅助部分辅助部分：信号屏蔽罩 微电极拉制仪 药物灌流设备 温度控制器3.6 全自动膜片钳设备的组成工作站工作站平板芯片平板芯片+即：即：德国Nanion公司Patchliner德国Nanion公司Syncropatch96美国MolecularDevices公司Ionworks3.7不同膜片钳技术的比较1 1 记录模式记录模式传统膜片钳传统膜片钳平板膜片钳平板膜片钳传统膜片钳传统膜片钳传统膜片钳传统膜片钳高信息量：通道功能的各项指高信息量：通道功能的各项指高信息量：通道功能的各项指高信息量：通道功能的各项指标、结合其他实验记录标、结合其他实验记录标、结合其他实验记录标、结合其他实验记录高灵敏度：高灵敏度：高灵敏度：高灵敏度：pApApApA级、单通道水平级、单通道水平级、单通道水平级、单通道水平适用范围广：不受样本种类限适用范围广：不受样本种类限适用范围广：不受样本种类限适用范围广：不受样本种类限制制制制l l操作过程复杂，对实验者要求操作过程复杂，对实验者要求操作过程复杂，对实验者要求操作过程复杂，对实验者要求高高高高l l实验数据量低，难以应用于药实验数据量低，难以应用于药实验数据量低，难以应用于药实验数据量低，难以应用于药物筛选物筛选物筛选物筛选全自动膜片钳全自动膜片钳全自动膜片钳全自动膜片钳操作自动化，简单培训即可使用操作自动化，简单培训即可使用操作自动化，简单培训即可使用操作自动化，简单培训即可使用高效率、高通量高效率、高通量高效率、高通量高效率、高通量实现某些传统膜片钳不具有的功实现某些传统膜片钳不具有的功实现某些传统膜片钳不具有的功实现某些传统膜片钳不具有的功能，例如全细胞模式内液灌流。能，例如全细胞模式内液灌流。能，例如全细胞模式内液灌流。能，例如全细胞模式内液灌流。l l保持传统膜片钳高信息量和高灵保持传统膜片钳高信息量和高灵保持传统膜片钳高信息量和高灵保持传统膜片钳高信息量和高灵敏度方面程度不一，敏度方面程度不一，敏度方面程度不一，敏度方面程度不一，l l样本兼容性不一样本兼容性不一样本兼容性不一样本兼容性不一2 2 各自的优缺点各自的优缺点离子通道研究离子通道研究n n 通道蛋白分离、通道重建和基因重组技术通道蛋白分离、通道重建和基因重组技术 利用与通道特异结合的毒剂标记，可把通道利用与通道特异结合的毒剂标记，可把通道蛋白质从膜上分离下来，经过纯化，可以测定各蛋白质从膜上分离下来，经过纯化，可以测定各亚单位多肽的分子量。然后，把它们加入人工膜，亚单位多肽的分子量。然后，把它们加入人工膜，可重新恢复通道功能。用于确定蛋白质氨基酸序可重新恢复通道功能。用于确定蛋白质氨基酸序列的基因重组技术的程序是：从细胞中分离出含列的基因重组技术的程序是：从细胞中分离出含有与该种通道蛋白相关的有与该种通道蛋白相关的mRNAmRNA，置入某种细胞，置入某种细胞(如大肠杆菌如大肠杆菌)，经逆转录得到，经逆转录得到cDNAcDNA。用限制性内。用限制性内切酶将切酶将cDNAcDNA切割成特定片段，再用核酸杂交方法切割成特定片段，再用核酸杂交方法钓出特定的钓出特定的DNADNA并克隆化。通过测定阳性克隆并克隆化。通过测定阳性克隆DNADNA的核苷酸顺序，推断出相应的蛋白质氨基酸的核苷酸顺序，推断出相应的蛋白质氨基酸序列。序列。