分子生物学工具酶.pptx

8/22/2024分子生物学工具酶分子生物学工具酶中晶生物8/22/2024工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切割、修饰、扩增,核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。概概 述述分类：分类：u 限制性内切酶u 连接酶u 逆转录酶u DNA、RNA聚合酶u 其它酶类大多数来自不同的微生物和噬菌体少数酶来自动物和动物病毒另一些工具酶编码的基因也被克隆出来,并用大肠杆菌细胞来生产这些工具酶。8/22/2024一、限制性内切酶5-GA A T T C-3 3-C T T A AG-5EcoRI#ER02715000u#ER02725x5000u#ER0273H,25000u市场容量：市场容量：1.5亿美金亿美金8/22/2024其命名以该酶来源的原核生物的名称为依据。第一个大写字母：取自于属名的第一个字母第二、三个小写字母：取自于种名的前两个字母字母后面罗马字：该种生物中不同限制酶分离先后顺序限制酶名称的前三个字母常用斜体或加下横线表示限制酶的命名限制酶的命名分离纯化：几千种限制性内切酶 商品化：200多种限制性内切酶限制酶的种类限制酶的种类8/22/2024限制性内切酶8/22/2024兰白反应兰白反应推荐缓冲液推荐缓冲液作用最适温度作用最适温度作用产物连作用产物连接效率接效率星号活星号活性性GC甲基化甲基化末端失活末端失活高浓度高浓度Genome Qualified限制性内切酶说明书限制性内切酶说明书8/22/2024Fermentas公司30多年研发生产历史，提供200多种高质量的工具酶通过ISO9002国际质量体系认证 v精湛的实验室研发技术和实力 具有全球第二大的产限制酶的菌株(2500株)库 REBASE 中30%限制酶经过Fermentas的鉴定 30%II型限制修饰相关基因在Fermentas得到克隆 全球率先合成了“人造”酶(Eco57MI,N.Bpu10I)v生产中执行最高级别的生产标准（LO Test）v致力于通过提高生产效率从而提升产品质量和价格竞争力v全球限制性内切酶(REs)生产的领先企业v市场份额：20左右，个别国家超过30的市场占有率8/22/2024执行最严格生产标准 PureExtremev自 1996 年以来，只有Fermentas始终执行分子生物学产品生产中最严格的纯度标准 “标记寡核苷酸测试”（the Labeled Oligonucleotide test，”LO”test）v独有的“标记寡核苷酸测试”确保 Fermentas 产品达到 PureExtreme级别v在限制酶、dNTPs、DNA/RNA 修饰酶等的生产中都进行了“标记寡核苷酸测试”传统分析方法包括：非特异性核酸酶内切分析、核酸外切酶分析、连接重切分析、蓝白斑筛选分析等。但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需选择更高灵敏度的检测方法：选择更高灵敏度的检测方法：LO Test8/22/2024Labeled Oligonucleotide(LO)test A Invitrogen B Roche C NEB D Stratagene E Promega F Fermentas 8/22/2024不同供应商RE LO检测分析-purecontaminatedminor contaminationX*8/22/202419962001通过通过LO检测的检测的REs(%)RocheInvitrogen NEBStratagene PromegaFermentas8/22/2024PureExtreme 限制性内切酶优势v所有Fermentas内切酶都达到 PureExtreme（致纯）最高品质保证v产品投诉少v严格的批间一致性 v保证产品质量稳定性 v几乎所以的酶都采用标准浓度 10 units/lv实时质量监督8/22/2024所有Fermentas RE在优化Buffer中有100%活性Easy-to-use Five Buffer Plus System每个Fermentas RE含两种buffer：-颜色区分，优化buffer：blue(B+)green(G+)orange(O+)red(R+)yellow(Y+/Tango)和-Universal Y/Tango Double Digest buffer浓度优化的BSA预先加入所有RE缓冲液中8/22/2024改进的 REsearch 提供DD最佳反应条件http:/ RE畅销排行榜（Top 20）v BamHIv BcuI(SpeI)v BglIIv EcoRIv Eco47IIIv Eco57Iv HindIIIv MboIv MnlIv NotIv NcoIv NdeIv NheIv PaeI(SphI)v SacIv SalIv TaiI(MaeII)v Tru1I(MseI)v XbaIv XhoI 补充：补充：PstI8/22/2024与竞争对手的比较vLO 测试 达到PureExtreme:无其它活性的污染v种类第二多 vISO9002 认证和质量控制 vFive Buffer Plus System，加有 BSAvY+/Tango，通用双酶切bufferv列出有效期,通过实时监控保证100活性v价格优势v未经LO测试,但有很多重组内切酶v种类第一多 v无认证，质量控制未核实v单独提供BSA v无双酶切用bufferv仅有出厂化验日期,距客户购买日期可能会有一年之久v价格相当Fermentas vs NEB8/22/2024与竞争对手的比较vLO 测试 达到PureExtreme:无其它活性的污染v种类第二多 vISO9002 认证和质量控制 vFive Buffer Plus System，加有 BSAvY+/Tango，通用双酶切bufferv列出有效期,实时监控保证100活性v价格优势v未经LO测试,v种类较少，约100种 v有认证，质量控制不严vBuffer中加有BSA v无双酶切用bufferv列出有效期v价格相当Fermentas vs Takara8/22/2024与竞争对手的比较vLO 测试 达到PureExtreme:无其它活性的污染v内切酶种类第二多vISO9002 认证和质量控制 v列出有效期,通过实时监控保证100活性vFive Buffer Plus System，加有 BSAvY+/Tango，通用双酶切bufferv专注于内切酶方面v价格优势v未经 LO测试v内切酶种类少v有认证v11种 buffers及 Multi-Core 4,不提供BSAv未提供双酶切的详细信息v非主要产品线v大幅度折扣Fermentas vs Promega8/22/2024与竞争对手的比较vLO 测试 达到PureExtreme:无其它活性的污染v内切酶种类第二多vISO9002 认证和质量控制 vFive Buffer Plus System，加有 BSAvY+/Tango，通用双酶切bufferv价格优势v未经 LO测试v有认证v非主要产品线v9种 buffers,不提供BSA v未提供双酶切的详细信息v大幅度折扣Fermentas vs Invitrogen8/22/2024FastDigest Restriction Enzymes8/22/2024FastDigest 限制性内切酶vFastDigest5min digestion1l of enzyme37oC temperatureONE bufferFor ALL FastDigest enzymes超过超过70多种多种FastDigest酶酶数量快速增长数量快速增长8/22/2024产品特点v独特的产品线v酶切质粒DNA只需5 min at 37Cv特殊的形式：1l enzyme v无需换算酶切单位v通用Buffer，针对所有的酶切实验 v一种温度：37C反应v200ng 纯化的质粒DNA(5 min酶切)v适合单酶切、双酶切和三酶切反应v操作简单：无需考虑酶量、Buffer、温度和星活性客户定位客户定位8/22/2024基因的体外突变等诸方面限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用各种DNA分子的体外重组限制酶谱的绘制基因的亚克隆分析基因和染色体结构的分析8/22/2024限制性内切酶使用常见问题分析（一）限制性内切酶使用常见问题分析（一）Q1、DNA完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割1)内切酶失活：标准底物检测酶活性2)DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3)条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳4)DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5)DNA酶切位点上没有甲基化（如DpnI）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增6)DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与DAN混匀进行切割验证7)DNA不存在该酶识别顺序：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证8/22/2024限制性内切酶使用常见问题分析（二）限制性内切酶使用常见问题分析（二）Q2、DNA切割不完全切割不完全1)内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化2)内切酶稀释不正确：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3)DNA不纯，反应条件不佳：同上4)内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰：同上5)部分DNA溶液粘在管壁上：反应前离心数秒6)内切酶溶液粘度大，取样不准：将内切酶稀释，增大取样体积7)酶切后DNA粘末端退火：电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8)由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡9)过度稀释使酶活性降低：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10)反应条件不适：使用最佳反应体系11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序：加大酶量5-10倍8/22/2024限制性内切酶使用常见问题分析（三）限制性内切酶使用常见问题分析（三）Q3、内切酶保存期内快速失活、内切酶保存期内快速失活1)保存温度不当：贮藏在含50%甘油的贮藏液中，-20低温保存2)以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用3)贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液4)低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存Q4、酶切后的、酶切后的DNA片段连接效率低片段连接效率低1)含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2)内切酶失活不全或含有ATP酶：内切酶失活不全或含有ATP酶3)平末端连接：加大T4DNALigase用量4)外切酶污染：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA5)连接缓冲液不合适：重新配制连接缓冲液8/22/2024限制性内切酶使用常见问题分析（四）限制性内切酶使用常见问题分析（四）Q6、电泳后、电泳后DNA片段的带型弥散，不均一片段的带型弥散，不均一1)DNA上结合有蛋白质：电泳前上样液65加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化2)内切酶中含有DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶Q5、DNA片段数目多于理伦值片段数目多于理伦值1)内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2)其它内切酶污染：用DNA作底物检查酶切结果3)底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，纯化DNA片段Q7、酶切后没有观察到、酶切后没有观察到DNA片段的存在片段的存在1)DNA定量错误（如RNA含量较高）：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量2)在酶切反应液中形成非特异的沉淀：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次8/22/2024DNA/RNA 修饰酶8/22/2024vT4 DNA Ligase(LO tested)vKlenow fragmentvT4 Polynucleotide KinasevT4 DNA PolymerasevRevertAid M-MuLV Reverse transcriptases(LO tested)vTerminal Deoxynucleotidyl Transferase(LO tested)vRibonuclease InhibitorvRibonucleasesvCalf Intestine Alkaline PhosphatasevShrimp Alkaline PhosphatasevProteinase KFermentas畅销修饰酶8/22/2024T4 DNA Ligase LO testedv单位：Fermentas 国际Weiss unit(ATP-PP exchange)NEB 粘端连接单位1 Weiss单位 200粘端连接单位 相关产品：Rapid DNA Ligation Kit Rapid DNA Ligation&Transformation Kit 8/22/2024Reverse transcriptasesAMV：从禽类成骨髓细胞瘤病毒中分离，有RNase H活性，42时比M-MuLV稳定，最高逆转录温度高达72度（Finnzymes）。增加逆转录的特异性，适合具有二级结构的模板RT RevertAid M-MuLV(LO Test)：从莫洛尼鼠白血病毒中分离，有RNase H活性。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA。M-MuLV(RNase H-)(LO Test)：从莫洛尼鼠白血病毒中分离，消除了RNaseH活性，适合合成全长的cDNA。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA，产量比含有RNaseH活性的酶要高很多。8/22/2024Ribonuclease Inhibitors（RNA酶抑制剂）概述v非共价1:1结合RNase，抑制RNases-A,B,C活性。v对Bacterial RNases H,T1,1,S1,U1,U2,CL3无效vLO Test：超纯，无其它酶蛋白污染v作用温度范围：25-55度，最佳反应稳定37度v适用PH值范围5.0-9.0应用：vRNA分离与纯化v体外转录，保证RNA转录本的完整性vcDNA合成：保护模板RNA、增加cDNA产率、增加全长cDNA比例vRT-PCR：保护模板RNA，增加RT-PCR产率8/22/2024 碱性磷酸酶（AP)应用:v除去载体和插入片段5-磷酸基团，预防载体或插入片段自连v采用T4多聚核苷激酶标记DNA/RNA末端前，除去5-磷酸基团vPCR产物测序前降解产物中的dNTPsv蛋白去磷酸化功能描述：v水解ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、核糖核苷和脱氧核糖核苷，释放磷酸基团 种类:v大肠杆菌碱性磷酸酶（BAP)v小牛肠碱性磷酸酶（CIAP)v虾碱性磷酸酶（SAP）8/22/2024Ribonucleases（核糖核酸酶）除去DNA中的RNA 种类vRNase A 特异性水解RNA中C和U碱基 vRNase T1-特异性水解RNA中G碱基 vRNase A/T1 Mix-RNase A和RNase T1混合物vRNase I NEW!序列非特异性，优先水解ssRNA 应用：v除去DNA溶液中的RNA，单核苷酸或寡核苷酸vRNase保护分析：vRNA定位分析 v印迹分析8/22/2024DNaseI,RNase freev识别并切割ssDNA和dsDNA，产生单核苷酸和寡核苷酸应用：制备 DNA-free的RNA，用于RT-PCR除去RNA转录系统中的DNA模板：DNA缺口翻译 DNaseI 印迹法 产生随机DNA文库单链特异性3-5核酸外切酶，分解ssDNA3-OH末端产生5-单核苷酸。对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA和RNA，80度加热15分钟失活。Exo I,E.coli