国外生物制品质量标准药典会.pptx

国外生物制品检验方法研究进展国外生物制品检验方法研究进展王军志王军志中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所提纲一.国际交流促进了质量标准研究与发展二.高端理化方法用于生物制品质量研究三.新生物学活性测定方法的研究四.热源检测替代方法研究一.国际交流促进了质量标准研究与发展 WHO 英国NIBSC 德国PEI 加拿大CBR 美国USP测量学（测量学（Metrology）：）：n测量结论基础:n方法验证（Validation）n追溯（Traceablity）n不确定性（Uncertainty）n随着测量技术进步，新的分析测量手段应用于生物测量中，如:芯片技术开发在基因水平对测序的评价方法。关于标准溯源（关于标准溯源（Traceablity Chain）：）：n 国际标准（SI）n NMIn 药典（Pharmacopoeias）n 协作标定实验室（Calibration Labs）n 常规测定实验室（Routine Measurement Labs）Bio-measurements主要含义：主要含义：1.采用生物学方法进行测量包括生物测定（Bioassays）、动物水平,细胞水平,分子水平的定量测定等。2.对生物制品本身结构特性的测定，如圆二色分析蛋白质、分子结合物表面共振分析等。n对于复杂的蛋白分子，理化测定方法虽然可以提供比较多的结构信息，但其不能完全反映蛋白质的高级结构。虽然生物学活性的测定值可信限范围比较大，但其作为特异的定量方法仍被广泛应用。n只有在理化结构的测定比较全面彻底，并且理化测定方法与生物学活性测定方法关系明确，同时生产工艺稳定时，理化方法才可以替代生物学活性测定方法。近年来随着新技术、新产品的出现，而使近年来随着新技术、新产品的出现，而使生物测量的含义不断得到充实和扩展：生物测量的含义不断得到充实和扩展：n基因递送体系的发展（基因治疗）n细胞治疗的发展（干细胞治疗）n生物相似性概念的发展NIBSC在生物测量中有三个比较突出的进展：在生物测量中有三个比较突出的进展：n免疫反应定量检测方法n将蛋白质组学技术用于疫苗的质量分析n生物测定终点法的合理发展（Rational development of bioassay end-points.”）英国英国NIBSC重点研究方向：重点研究方向：n针对基因治疗载体的分析方法研究n干细胞分化状态下，抗原表达分析n治疗用糖蛋白生物活性与糖基化相关性研究n细胞因子治疗病人的抗体分析标准方法n采用定量、伦理方式改善及替代测定方法n以毒素效价为基础的毒性评价方法NIBSC将蛋白组学在疫苗质量控制中的应用：蛋白组学在疫苗质量控制中的应用：n以以Meningococcal OMV vaccine为例，为例，n采用I-D SDS-PAGE电泳法，可以得到29条区带，采用质谱分析出40种蛋白多肽的序列。其中证明7种为关键抗原成份。n采用二维电泳法（2D-PAGE）发现152斑点，采用MS/MS法分离出74个多肽位段可以代表41个不同基因的产物。n采用2D-PAGE法分析两个企业同类产品，斑点数有显著差异。n免疫蛋白组学可以通过分析混合蛋白，研究哪些是有用，哪些是无用的，从而确定抗原保护成份。Example:Complexity of vaccinesProteomics-based identification of antigenically-active components present in OMVVaccines against Meningococcal group B disease1Is the concept of a“biological”(not characterisable by physico-chemical means alone)still valid?生物测定终点法生物测定终点法n以细胞早期分子变化测定为基础：以细胞早期分子变化测定为基础：nVEGF的生物学测定采用细胞内信号变化进行。q-PCR检测mRNA表达水平。通过IL-8mRNA诱导的VEGF活性测量。n通常采用抗病毒检测法测定-干扰素活性需要3天，而q-PCR法8小时就可以达到目的。nRNA可直接通过细胞裂解物测定，不需要纯化或酶处理。n生物测定终点法的发展（生物测定终点法的发展（Bioassay end-point development）：）：nq-PCR方法可直接测定细胞早期的成份变化，可减少差异，改善灵敏度。n内源性mRNA的测定不需稳定感染细胞的传代，并作为基因检测的报告实例。n该技术可用于检测参考品和治疗产品效价，还可用于对更复杂材料（如血清）的诊断测定（中和抗体）。n提高生物测定速度，如q-PCR法与传统理化测定技术共用，可以在线监测产品质量。出访情况简介出访情况简介n访问时间：访问时间：2009年年5月月37日日n地点：渥太华，加拿大地点：渥太华，加拿大卫生部生物制品质量研卫生部生物制品质量研究中心（究中心（Center for Biologics Research,CBR）n人员人员:王军志王军志 叶强叶强 李长贵李长贵n内容：参加内容：参加“中加生物中加生物制品质量控制制品质量控制 研讨会研讨会”并访问并访问CBR 参观参观CBR实验室实验室与批签发部门的交流与批签发部门的交流n疫苗批签发由生物制品评价中心的实验室疫苗批签发由生物制品评价中心的实验室承担承担n批签发实行分级管理，根据生物制品的种批签发实行分级管理，根据生物制品的种类、风险性进行评估，将其分为四个等级，类、风险性进行评估，将其分为四个等级，如新疫苗和活疫苗为最高等级，除资料审如新疫苗和活疫苗为最高等级，除资料审核外，还需进行关键项目的实验室检测，核外，还需进行关键项目的实验室检测，最低等级的制品只进行资料审核。最低等级的制品只进行资料审核。n分级管理是动态的分级管理是动态的对对CBR研究特色的体会研究特色的体会n生物生物/化学化学/分离方法的有机结合对分离方法的有机结合对生物制品结构和功能的相关性研究生物制品结构和功能的相关性研究n以各种高技术分析方法对生物制品以各种高技术分析方法对生物制品质量进行深入研究质量进行深入研究n新检测方法的研究新检测方法的研究-新颖性、实用新颖性、实用性性n对生物制品前沿领域的把握对生物制品前沿领域的把握二.高端理化方法用于生物制品 质量研究1.生物生物/化学化学/分离方法结合分析糖蛋白分离方法结合分析糖蛋白单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用HPAEC-PAD（高（高pH阴离阴离子交换色谱和脉冲电流检测仪）子交换色谱和脉冲电流检测仪）分析方法可以看到不同条件下分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异的单抗的结构差异1.生物生物/化学化学/分离方法结合分析制品质量分离方法结合分析制品质量单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用FACE（荧光辅助糖电泳（荧光辅助糖电泳）质谱分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异质谱分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异FACE分析分析MALDI-QqTOF-MS分析分析2.流感疫苗质量分析流感疫苗质量分析应用应用NanoLC/MS方法分析同一企业三批流感疫苗的质量方法分析同一企业三批流感疫苗的质量红蓝绿代表三批制品红蓝绿代表三批制品2.流感疫苗质量分析流感疫苗质量分析应用应用NanoLC/MS方法分析三个企业流感疫苗的质量方法分析三个企业流感疫苗的质量3.EPO糖基化分析糖基化分析EPO-EPO-不同企业的不同企业的EPO通过毛细管电泳通过毛细管电泳发现有不同的糖发现有不同的糖基化形态基化形态.成品分析，能在成品分析，能在高浓度保护剂存高浓度保护剂存在时分析在时分析3.EPO糖基化分析糖基化分析Migr.TimePeak Area%Mfr.Spec.Glycoform 1unresolved-5Glycoform 2(+1)16.153356416.05-25Glycoform 316.406353730.320-35Glycoform 416.676571831.325-40Glycoform 5(+6)16.974685522.415-35Glycoform 6unresolved-0.05(对对3个不同代进行比较个不同代进行比较)2)CV=5.02%(好于预期可接受的好于预期可接受的20-30%的范围的范围)n基质（基质（4 4批）批）1)P=0.08 or 0.05 2)CV=11.88%(好于好于 20-30%)n操作人（操作人（3 3个）个）1)CV=9-11.43%(individual very good).2)P=0.012,3个操作人个操作人:无差异无差异.n特异性特异性：线性反应中，线性反应中，IFN均不与其他细胞因子均不与其他细胞因子(TNF,GM-CSF,IL-2,IL-4,etc.up to 15 cytokines tested)反应反应。n复制数：复制数：5 per cell(18株克隆中有株克隆中有1株合适株合适)n样品来源：与产品标签相符合（人注射用）样品来源：与产品标签相符合（人注射用）n检测范围：检测范围：0 3200 IU/mL（远大于其他报道过的方法）（远大于其他报道过的方法）n不同天数：无差异（不同天数：无差异（CV=5.6%）新方法的优点新方法的优点:n新方法较传统方法更加简便、快速、客观及新方法较传统方法更加简便、快速、客观及具有更好稳定性。具有更好稳定性。n对大量克隆细胞进行筛选与分析后，在对大量克隆细胞进行筛选与分析后，在1818个个子克隆中仅有子克隆中仅有1 1株适用于试验。株适用于试验。nCBRCBR试验优于以前报道研究过的试验体系：试验优于以前报道研究过的试验体系：如细胞更加稳定如细胞更加稳定(56 passage vs.15(56 passage vs.15 passages),passages),检测范围更宽等。检测范围更宽等。干扰素测活新方法的研究干扰素测活新方法的研究(NICPBP)n构建细胞株 293细胞中插入干扰素刺激 反应元件（ISRE）用嘌呤 霉素稳定n实验步骤 铺板、加样 培养21h 加入Bright Glo luciferase reagent 读数技术路线技术路线干扰素测活新方法的研究干扰素测活新方法的研究干扰素测活新方法的研究干扰素测活新方法的研究药物类别类别药物类别类别药物批号药物批号药物效价药物效价回收率回收率原有方法原有方法测量效价测量效价IFN2a200905032.93*1062.81*106200820105.73*1065.87*1065.79*10697%5.84*106IFN2b2009091926.71*1067.25*106200706046.49*1066.52*1066.27106103%6.78*106IFN1b200808019.4*1049.6*10400904083.76*1053.82*1053.73*10593%3.68*105前期实验结果前期实验结果3.新检测方法的研究新检测方法的研究百日咳残余毒素的研究百日咳残余毒素的研究FetuinN3-glycan SubstrateCOLOURCOLOURAnti-PT antibodyHRP-secondary antibodyHRP*Gomez et al.2006 Anal Biochem 356:244-253PTxpH 10.2pH 10.2pH 7.4pH 7.4百日咳毒素(PTx)百日咳类毒素PTd)四.替代定量方法研究1,流感病毒通用抗体流感病毒通用抗体1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 (-)(+)Influenza HA subtypes8060504030HA0HA2针对流感病毒血凝素的通用抗体针对流感病毒血凝素的通用抗体1,流感病毒通用抗体流感病毒通用抗体2.单核细胞活化试验简介单核细胞活化试验简介n单核细胞活化试验单核细胞活化试验(the monocyte activation test，MAT)为一种检测药品中炎性因子及热原污染物质的为一种检测药品中炎性因子及热原污染物质的体外试验新方法。体外试验新方法。n依单核细胞来源不同可将该方法大致分为以下三类依单核细胞来源不同可将该方法大致分为以下三类:人外周血单个核细胞（人外周血单个核细胞（PBMNCPBMNC）法）法 单核细胞系法（如单核细胞系法（如THP-1THP-1、MM-6MM-6）人全血法人全血法 MAT法基本原理法基本原理IL-6 热原物质刺激单核细胞热原物质刺激单核细胞(如人外周血单个核细胞，如人外周血单个核细胞，PBMNC)后后,导致其形态改变并释放某些能致机体发热的蛋白进入血液。导致其形态改变并释放某些能致机体发热的蛋白进入血液。因该类蛋白可引起机体体温升高，又将其称为内致热原，其成分因该类蛋白可引起机体体温升高，又将其称为内致热原，其成分主要为各类细胞因子主要为各类细胞因子(如如IL-6、IL-1、TNF-等等)。MAT法基本原理法基本原理nMAT法将热原物质、受试药品分别与单核细胞法将热原物质、受试药品分别与单核细胞孵育，通过免疫化学分析法孵育，通过免疫化学分析法(如如ELISA)检测与检测与比较孵育体系中细胞因子的含量，比较孵育体系中细胞因子的含量，反映药品中反映药品中各类炎性因子及热原物质的污染情况。各类炎性因子及热原物质的污染情况。MAT法主要特点法主要特点n针对家兔热原检查法使用活针对家兔热原检查法使用活体动物进行体内实验的问题，体动物进行体内实验的问题，MAT法为一种不使用动物的法为一种不使用动物的体外实验方法体外实验方法n针对细菌内毒素检查法只能针对细菌内毒素检查法只能特异性检测内毒素的问题，特异性检测内毒素的问题，MAT法能检测出较多种类法能检测出较多种类（包括内毒素与非内毒素来（包括内毒素与非内毒素来源）的热原物质源）的热原物质Limulus crabs系列浓度内毒素标准品刺激系列浓度内毒素标准品刺激PBMNC 分泌分泌IL-6试验试验IL-6(pg/ml)Endotoxin concentration(EU/ml)The data from Robin Thorpe PhD.,NIBSC.系列浓度受试药品（系列浓度受试药品（Contaminated Factor VIII）刺激）刺激PBMNC分泌分泌IL-6试验试验Samples negative in therabbit pyrogen test&bacterial endotoxins testLPS(EU/ml)MAT（PBMC/IL-6）法用于检测内毒素及）法用于检测内毒素及非内毒素来源热原物质非内毒素来源热原物质 The data from Robin Thorpe PhD.,NIBSC.Four initial donorsDrug complies with specificationREJECTACCEPTContinuation with four additional donorsDrug complies with specificationACCEPTREJECTNO(1-4 positive responses)NO (2-4 positive responses)YES(0 positive responses)YES(0 positive responses)YES (1 positive response)MAT法判断标准法判断标准(4/4 or 7/8 donors)MAT法国外发展与应用概况法国外发展与应用概况n欧洲药典欧洲药典“MAT专家组专家组”于于2008年年11月在法国斯特拉斯堡完成了对该月在法国斯特拉斯堡完成了对该方法专论的起草，并于方法专论的起草，并于2009年年3月提交至欧盟，计划于月提交至欧盟，计划于2010年将年将MAT法作为家兔热原实验的正式替代方法。法作为家兔热原实验的正式替代方法。n在某些药害事件中，在某些药害事件中，NIBSC已将已将MAT法用于检测某些治疗性免疫制剂法用于检测某些治疗性免疫制剂（如（如TGN1412）的非必要内在活性（该活性在临床前评价中均未发现）的非必要内在活性（该活性在临床前评价中均未发现！）。！）。MAT法国内研究现状法国内研究现状n国内对该方法的研究始于国内对该方法的研究始于2002年，中国药品生物年，中国药品生物制品检定所相关科室已对包括人全血法、人外周制品检定所相关科室已对包括人全血法、人外周血单个核细胞法、血单个核细胞法、THP-1法在内的法在内的MAT法进行了法进行了较全面地基础研究，已基本建立该类方法并应用较全面地基础研究，已基本建立该类方法并应用于某些药品（如中药注射液、疫苗类产品等）的于某些药品（如中药注射液、疫苗类产品等）的热原检测中。热原检测中。n现计划对该方法应用于实际药品热原控制做进一现计划对该方法应用于实际药品热原控制做进一步应用研究，为其进入步应用研究，为其进入2015年版药典积累详细的年版药典积累详细的资料。资料。Acknowledgment(致谢):nDr.Robin NIBSC nDr.Li Seal CBR CanadanDr.Misheal CBR Canada nLi Changgui(李长贵)nYe Qiang(叶强）nLi Juan(李娟）nXu ranran(徐然然)nZhang Shuming(张庶民)others