HPLC一般性故障排除.pptx

2024/8/10 周六 于保生记录:完成分析的维修数据标准色谱图运行记录本DateLogbookService11/2/9412/1/9412/4/94check valvespump sealsnew column要保留记录HPLC 色谱柱的测试对新拿到的色谱柱进行等度洗脱的记录:记录理论塔板数,N,同时有:色谱柱的长度和直径化合物的和 k 值流动相和固定相流动相流速样品量温度峰对称性.包括,酚和胺 为测试抗酸、碱性.记录:柱压完成分析维修数据2024/8/10 周六 于保生pH范围n仪器 pH 范围 2.3-9.5n扩展 pH范围 2.3-12.5腐蚀不锈钢n盐酸n无机酸和强酸n碱金属卤化物(氯化纳,碘化锂)n四氯化碳和2-异丙醇或THF n络合剂(EDTA,柠檬酸,乙酸)侵蚀石英和vespeln碱性溶液,pH11使用上述物质时HPLC要经常性维护，如果使用，HPLC的泵和其他部件在完成实验后要彻底冲洗.关心照顾HPLC 避免出现故障2024/8/10 周六 于保生保留时间和峰面积的重复性可能造成保留时间的故障:流动相组成变化溶剂输送系统故障色谱柱平衡问题色谱柱故障色谱柱箱温度可能造成峰面积问题的原因:进样器故障泵流路故障检测器平衡故障峰保留时间精密度:有柱箱:0.3%无柱箱:0.7%峰面积精密度:1.5%2024/8/10 周六 于保生一般泵故障夹带空气流动相脱气使泵初始化阀密封件活塞泄漏2024/8/10 周六 于保生手动进样阀色谱柱故障不合适的注射体积或型号阀堵塞进样口泄漏样品携留交叉口泄漏手动进样阀-六通固定进样环到废液池进样环(定体积)来自泵到色谱柱样品注射器加样进样到色谱柱2024/8/10 周六 于保生故障故障:n有关样品在未预先充样时针和管道被堵塞当样品瓶中有密度梯度时，峰高重复性差n针由于隔垫造成的堵针针弯曲排除排除:n需要时更换针座n需要时更换针n需要时更换自动进样器中的转子或密封圈自动进样器样品试剂试剂进样单元计量装置来自泵到色谱柱6-位阀到废液瓶2024/8/10 周六 于保生一般性检测器故障沾污的流通池老灯2024/8/10 周六 于保生时间mAU用于参考的基线噪音测定以mAU或RI单位记录基线宽度，用于以后的比较.检测器性能2024/8/10 周六 于保生数据速度数据速度 20 Hz响应时间响应时间 0.1 secPW 0.1 min收集收集40 pts 收集收集5 pts 收集收集100 pts 收集收集12 pts 检测器时间常数-太高2024/8/10 周六 于保生滤波过度滤波不够太高太低时间常数时间(min.)丢失信息信息过多检测器时间常数-太低2024/8/10 周六 于保生压力故障压力故障压力过高压力过高压力过低压力过低压力波动压力波动l在柱进口处塞子毛细管松动在柱进口处塞子毛细管松动l检查进样器到针座的毛细管检查进样器到针座的毛细管l使系统在半途停下来一直到使系统在半途停下来一直到找到堵塞处找到堵塞处l确定流动相是正确的确定流动相是正确的l拧紧松动的接头或更换接拧紧松动的接头或更换接头头l更换计量泵密封圈更换计量泵密封圈l更换或清洗堵塞的溶剂进更换或清洗堵塞的溶剂进样塞样塞l脱气并使泵初始化脱气并使泵初始化l检查松动或不适当密检查松动或不适当密封的接头封的接头l检查计量泵密封圈检查计量泵密封圈l检查溶剂进样塞检查溶剂进样塞排除压力故障2024/8/10 周六 于保生基线波动故障来自检测器还是泵?你怎样说明?故障:色谱仪基线波动。2024/8/10 周六 于保生故障:+静态混合器混合故障故障:一种UV吸收的流动相和非UV吸收的流动相动态混合。有UV-吸收的残余流动相。泵噪音引起。解决办法:增加一个混合器.缺点是死体积增加。2024/8/10 周六 于保生有换热器无换热器时间(min.)检测器-热交换器保证流通池恒温提高检测器性能。2024/8/10 周六 于保生时间(min.)基线噪音可能的原因:流通池脏检测器灯坏泵出现周期性的脉冲检测器的温度影响空气泡进入检测器回答问题:你改变了流动相成分吗?你改变了波长吗?你的仪器最后一次使用什么流动相?你有混溶性的问题吗?你的溶剂脏了吗?2024/8/10 周六 于保生色谱柱维修/再生-物理性堵塞装上色谱柱/不装色谱柱时检查柱压降如果柱两端反压高，把色谱柱倒过来用流动相冲洗10-20个柱体积，再测试反压如果有沉淀,(即聚集的蛋白质，细胞物质，聚合物）用适当可溶解的溶剂清洗堵塞物，如0.1%TFA/80%乙腈,6M胍，HCl,THF,HFIP如果不成功，更换塞子2024/8/10 周六 于保生进样口塞子柱进样柱进样口塞子口塞子压缩性密封圈压缩性密封圈柱体柱体母接头母接头公接头公接头l磨损套磨损套l不要让柱床干了不要让柱床干了l不要触摸色谱柱不要触摸色谱柱-柱体热了会把填料柱体热了会把填料挤出来挤出来l不要过紧不要过紧2024/8/10 周六 于保生1.小心地卸下柱塞子2.做流动相匀浆3.用一个 Pasteur 管,把固定相堆放到柱顶部4.装一个新的塞子到堆放固定相柱的顶部，重新装上柱接头老塞子新塞子更换柱塞子2024/8/10 周六 于保生色谱柱维修/再生-用化学方法改变色谱柱由于键合相的水解或硅胶溶解使柱填料的改变是不可逆的由于污染而造成柱填料的改变一般是可逆的，可用适当的溶剂冲洗掉梯度洗脱方式（水-强溶剂）常常十分有效低pH流动相，如.0.1%TFA 或 0.01M H3PO4，很有效提高温度也有帮助(60-80).2024/8/10 周六 于保生基线漂移梯度洗脱温度不稳定(示差折光检测器)流动相污染流动相在柱中没有平衡系统有污染物流失2024/8/10 周六 于保生20%-100%MeOH 梯度未进样鬼峰-甚至未注射样品也有峰出现故障-流动相脏601530150371517鬼峰2024/8/10 周六 于保生正常双峰柱中有死体积峰形-双峰柱中有死体积塞子部分被堵只有一个双峰-共流出化合物2024/8/10 周六 于保生峰形-加宽峰所有的峰加宽柱效降低柱死体积进样量大流动相粘度高.某些峰加宽前一个样品的洗脱峰分子量大样品-蛋白质或聚合物柱柱 A1826个柱体积之后起始(SilGel 硅胶;单封端)1.尿嘧啶2.去甲替林3.多虑平4.阿米替林5.三甲丙咪嗪12345柱柱 A2024/8/10 周六 于保生0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11柱外柱外体积体积10 L20 L时间（分钟）时间（分钟）2.1 x 150 mmF=0.2 mL/min.(进样进样1L)柱外体积在进样器和色谱柱以及色谱柱和检测器之间使用短而内径细的管子所有的管件一定要使用匹配的接头使用小体积的检测池进样体积要小2024/8/10 周六 于保生正常拖尾正常拖尾 对称性 1.2峰形-拖尾原因原因:一些峰拖尾次要的-保留效应残留硅醇基作用在大峰上有小峰洗脱出来所有的峰拖尾超柱效应在柱进口处污染物增加重金属色谱柱不好2024/8/10 周六 于保生正常前伸峰对称性 0.920001500100050000510152025时间T(min)mAU色谱峰形-前伸峰原因:柱过载小峰在大峰前洗脱出来2024/8/10 周六 于保生正常负峰色谱峰形-负峰原因原因:样品的吸光度小于流动相当样品溶剂通过色谱柱时平衡的扰动对示差折光检测器来说是正常的