固定化的酶与微生物.pptx

一、固定化的酶与固定化微生物的概念一、固定化的酶与固定化微生物的概念 是一类由生物细胞产生的具有催化功能的生是一类由生物细胞产生的具有催化功能的生物大分子（蛋白质），通常称作生物催化剂物大分子（蛋白质），通常称作生物催化剂酶酶:l固定化酶固定化酶(inmobilized enzyme)(inmobilized enzyme)是用适当的物理、化学方法把纯化的是用适当的物理、化学方法把纯化的酶固定于一定的空间内，使其成为既保持了酶固定于一定的空间内，使其成为既保持了本身的特性，又能在连续反应之后可以回收本身的特性，又能在连续反应之后可以回收和重复使用的一种制品和重复使用的一种制品 是用适当的物理、化学方法把纯化的是用适当的物理、化学方法把纯化的微生物固定于一定的空间内，使其成为既保持固定于一定的空间内，使其成为既保持了本身的特性，又能在连续反应之后可以回了本身的特性，又能在连续反应之后可以回收和重复使用的一种制品收和重复使用的一种制品 固定化微生物固定化微生物l固定化酶和固定化微生物的研究历史固定化酶和固定化微生物的研究历史:1916年年Nelson和和Griffin发现发现:有些酶虽然不溶于水，但是仍存在催化活有些酶虽然不溶于水，但是仍存在催化活性现象性现象 1953年年Grubhofer和和Schleith真正开始固定化酶的研究真正开始固定化酶的研究1960年之后，年之后，Katzir-Katchalski学派对酶的固定方法和固定化酶的理化学派对酶的固定方法和固定化酶的理化性质做了大量的工作，并将其成功地应用于工业生产性质做了大量的工作，并将其成功地应用于工业生产 1969年千烟一郎也成功地将固定化氨基酰化酶应用于年千烟一郎也成功地将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学氨基酸的光学拆分过程，使其反应实现了连续化拆分过程，使其反应实现了连续化 1973年千烟一郎研制成了大肠杆菌年千烟一郎研制成了大肠杆菌(Ecoli)的固定化细胞，即所谓的固定化细胞，即所谓固定固定化微生物化微生物，并将其用于连续生产，并将其用于连续生产L-天门冬氨酸过程。天门冬氨酸过程。固定化微生物虽然仅较固定化微生物虽然仅较适用于催化小分子物质适用于催化小分子物质的转化的转化，并伴随发生分解生成物等，并伴随发生分解生成物等副反应副反应，但它工，但它工序简单、稳定性好、酶活力丧失少、成本低廉，以序简单、稳定性好、酶活力丧失少、成本低廉，以及利用其固有的多酶系统可对有机体的代谢途径进及利用其固有的多酶系统可对有机体的代谢途径进行研究行研究l固定化微生物的特点固定化微生物的特点:本章将就固定化的酶与微生物的制备方法及其本章将就固定化的酶与微生物的制备方法及其制品的性质和应用进行讨论制品的性质和应用进行讨论 三、固定化酶三、固定化酶的制备的制备（一）酶固定化的前提条件（一）酶固定化的前提条件 酶的活性中心酶的活性中心(催化部分催化部分)和空间结构和空间结构(结合部结合部分分)的维持是其具有催化活力的必需条件。因此，的维持是其具有催化活力的必需条件。因此，在制备固定化酶时，要尽可能避免采用剧烈的在制备固定化酶时，要尽可能避免采用剧烈的条件（过高的温度和盐浓度、强酸和强碱，以条件（过高的温度和盐浓度、强酸和强碱，以及各种有机溶剂等）处理。不然，酶的催化作及各种有机溶剂等）处理。不然，酶的催化作用会降低，甚至丧失，或者改变酶对底物的专用会降低，甚至丧失，或者改变酶对底物的专一性一性 （二）（二）酶的固定化方法酶的固定化方法 l固定化酶制备方法，根据制备原理分类：固定化酶制备方法，根据制备原理分类：l制备固定化酶的模式图：制备固定化酶的模式图：1载体结合法载体结合法(1)物理吸附法物理吸附法 载体类型：载体类型：是将酶蛋白吸附到水不溶性的惰性载体是将酶蛋白吸附到水不溶性的惰性载体(它是以共价或非共价键它是以共价或非共价键结合其他物质的一种基质结合其他物质的一种基质)上制成固定化酶的过程。上制成固定化酶的过程。制备原理：制备原理：常为疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、常为疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、羟基磷灰石、磷酸钙凝胶以及淀粉等物质。羟基磷灰石、磷酸钙凝胶以及淀粉等物质。酶与载体的相互作用较弱，二者之间易于分离。酶与载体的相互作用较弱，二者之间易于分离。缺缺 点：点：酶活力不易丧失，蛋白质的空间结构不发生明显变化。酶活力不易丧失，蛋白质的空间结构不发生明显变化。优优 点：点：(2)离子结合法离子结合法 载体类型：载体类型：将酶以离子结合的方式固定到具有离子交换基团的非水溶性载将酶以离子结合的方式固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上制成的固定化酶体上制成的固定化酶。制备原理：制备原理：常为带各种离子基团的硅胶、纤维素、交联葡聚糖和树脂等物质常为带各种离子基团的硅胶、纤维素、交联葡聚糖和树脂等物质。酶与载体的结合力不高，且易受缓冲液类型和酶与载体的结合力不高，且易受缓冲液类型和pH值高低的影响。值高低的影响。应用这种固定化酶反应时，溶液的应用这种固定化酶反应时，溶液的pH值、离子强度、温度和底值、离子强度、温度和底物浓度发生变化，往往可引起酶的脱落。物浓度发生变化，往往可引起酶的脱落。缺缺 点：点：优优 点：点：操作较简便、条件较温和、酶活力不易丧失。操作较简便、条件较温和、酶活力不易丧失。(3)共价结合法共价结合法 是将酶的非必需基团是将酶的非必需基团(-氨基，氨基，-氨基，氨基，、-羧基，羟基，羧基，羟基，咪唑基等咪唑基等)通过共价键或整合剂偶联于固相载体上而制成固定通过共价键或整合剂偶联于固相载体上而制成固定化酶。化酶。制备原理：制备原理：有硅胶、纤维素、琼脂糖和交联葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝胶有硅胶、纤维素、琼脂糖和交联葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝胶等物质。等物质。酶与载体结合很牢固，使用周期长（该法目前应用较为普遍）。酶与载体结合很牢固，使用周期长（该法目前应用较为普遍）。优优 点：点：载体类型载体类型:操作较复杂、条件较剧烈、酶活力丧失较多。操作较复杂、条件较剧烈、酶活力丧失较多。缺缺 点：点：l根据偶联反应方式类型的不同，可将共价结合法分为：根据偶联反应方式类型的不同，可将共价结合法分为：共价结合法共价结合法 重氮法重氮法多肽法多肽法烷化法烷化法缩合剂法缩合剂法载体交联法载体交联法 叠氮法叠氮法 卤化氰法卤化氰法 载体共价交联法载体共价交联法 “酶网酶网载体法载体法 重氮法重氮法制备原理：制备原理：常用载体常用载体:先先将将载载体体（带带氨氨基基的的芳芳香香族族化化合合物物R-Y-NH2）用用稀稀盐盐酸酸和和亚亚硝硝酸酸钠钠（相相当当于于亚亚硝硝酸酸）处处理理生生成成重重氮氮盐盐化化合合物物，然然后后与与酶酶蛋蛋白白的的酚酚基基、咪咪唑唑基基发发生生偶偶联联反反应应(游游离离氨氨基基也也能能发发生生十十分分缓缓慢的反应慢的反应)，制成固定化酶（形成偶氮化合物），制成固定化酶（形成偶氮化合物）有对氨苄基纤维素、聚氨基聚苯乙烯、有对氨苄基纤维素、聚氨基聚苯乙烯、3-对对-氨苯氧基氨苯氧基-2-羟羟丙酰纤维素、氨基酸共聚物、交联葡聚糖丙酰纤维素、氨基酸共聚物、交联葡聚糖-氨茴香酸酯等氨茴香酸酯等弱酸性环境弱酸性环境加入酶蛋白，低温（加入酶蛋白，低温（05）多多肽肽法法 利用肽的合成原理，使酶蛋白和载体之间以肽键连利用肽的合成原理，使酶蛋白和载体之间以肽键连接而制成固定化酶的过程。它又分叠氮法和卤化氰法接而制成固定化酶的过程。它又分叠氮法和卤化氰法等等叠叠 氮氮 法法先先用用羧羧甲甲基基纤纤维维素素甲甲酯酯与与水水合合肼肼作作用用形形成成酰酰肼肼，然然后后再再与与亚亚硝硝酸酸反反应应得得到到叠叠氮氮化化合合物物，再再在在低低温温条条件件下下，该该化化合合物物和和酶酶的的游游离离-NHNH2 2、-OHOH和和-SHSH反反应应形形成成肽肽键键，即即偶偶联联成固定化酶成固定化酶卤化氰法卤化氰法此法与第七章此法与第七章“亲和层析亲和层析”中亲和吸附剂的制备原理相似。中亲和吸附剂的制备原理相似。先用卤化氰先用卤化氰(常用的是溴化氰常用的是溴化氰CNBrCNBr)活化纤维素、交联葡聚活化纤维素、交联葡聚糖和琼脂糖等多糖类载体，然后在偏碱性环境条件下，使糖和琼脂糖等多糖类载体，然后在偏碱性环境条件下，使载体（基质）与酶（配体）进行偶联，即可制成固定化酶载体（基质）与酶（配体）进行偶联，即可制成固定化酶 烷基化法烷基化法制备原理：制备原理：常用载体常用载体:利用蛋白质利用蛋白质N末端游离末端游离-NHNH2 2、Tyr Tyr 的的Ph Ph OH OH、CysCys的的OHOH等与等与含卤族功能团的非水溶性载体发生烷基化反应（由酶蛋白取含卤族功能团的非水溶性载体发生烷基化反应（由酶蛋白取代卤族功能团）制成固定化酶代卤族功能团）制成固定化酶氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素、聚乙二氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素、聚乙二醇碘乙酰纤维素和二氯醇碘乙酰纤维素和二氯-S-三嗪基纤维素等。其中二氯三嗪基纤维素等。其中二氯-S-三嗪基纤维素是带正电荷的，它对中性或碱性的酶蛋白、三嗪基纤维素是带正电荷的，它对中性或碱性的酶蛋白、或作用于带负电荷底物的酶蛋白进行固定化较为有利，或作用于带负电荷底物的酶蛋白进行固定化较为有利，用其制备的固定化酶活力较高。用其制备的固定化酶活力较高。缩合剂法缩合剂法 将酶（含将酶（含-COOH和和-NH2）与含与含-NH2和和-COOH的载体（的载体（R-NH2 或或 R-COOH）在缩合剂碳化在缩合剂碳化二亚胺（二亚胺（R1-N=C=N-R2）或伍德沃德试剂或伍德沃德试剂K(N-乙基乙基-5-苯异口恶唑苯异口恶唑-3-磺酸磺酸)作用下进行缩合反作用下进行缩合反应，制成固定化酶应，制成固定化酶制备方法：制备方法：载体交联法载体交联法 这种制备固定化酶的方法有的地方把它归到交联法。这种制备固定化酶的方法有的地方把它归到交联法。因为它们都是通过一个中间工具因为它们都是通过一个中间工具“交联剂交联剂”（如戊二醛（如戊二醛等）将酶固定化的。载体交联法是在酶与载体之间进行等）将酶固定化的。载体交联法是在酶与载体之间进行交联，使酶固定化；而交联法是在酶分子与酶分子之间交联，使酶固定化；而交联法是在酶分子与酶分子之间进行交联，制成网状结构的固定化酶进行交联，制成网状结构的固定化酶2、交联法、交联法 交交联联法法是是酶酶分分子子之之间间在在双双功功能能基基团团交交联联剂剂作作用用下下，相相互互交交联联呈呈网网状状结结构构的的固固定定化化酶酶过过程程。最最常常用用的的交交联联剂剂是是戊戊二二醛醛，它它和和酶酶蛋蛋白白中中的的游游离离氨氨基基形形成成希希夫夫氏氏(Schiff)碱碱，从从而而使使酶酶分分子子之之间间相相互互交交联联成成固固定定化酶。化酶。此此外外，顺顺丁丁烯烯二二酸酸酐酐或或乙乙烯烯共共聚聚物物与与酶酶分分子子在在六六甲甲撑撑二二氨氨作作用用下下，相相互互间间进进行行反反应应，亦亦可可制制成成固固定定化酶化酶3、包埋法、包埋法定义：定义：就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高分子半透膜中制成固定化酶的方法分子半透膜中制成固定化酶的方法 分类：分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型由于包埋法由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单这种固定化酶制品却只能应用于底物和产物的分子质量都小的这种固定化酶制品却只能应用于底物和产物的分子质量都小的反应中反应中优点：优点：缺点：缺点：四、固定化微生物四、固定化微生物的制备的制备 目目前前，固固定定化化微微生生物物的的制制备备方方法法最最多多的的是是包包埋埋法法，其其次次是是载载体体结结合合法法和和交交联联法法；另另外外，还还有有用用选选择择性性热热变变法法制制备备固固定定化化微微生生物物的的，就就是是将将细细胞胞在在适适当当温温度度下下进进行行处处理理，使使细细胞胞膜膜蛋蛋白白变变性性，但但不不使使酶酶变变性性而使酶固定与细胞内的方法而使酶固定与细胞内的方法 采用包埋法制备的部分固定化微生物及其用途采用包埋法制备的部分固定化微生物及其用途五、固定化酶和固定化微生物的性质五、固定化酶和固定化微生物的性质（一）相对活性（一）相对活性固定化酶固定化酶(或微生物或微生物)的活力，通常用的活力，通常用“相对活力相对活力”表示，即以固定化酶表示，即以固定化酶(或微生物或微生物)的活力与同样量游的活力与同样量游离酶活力之比称为相对活力；一般用百分数表示。离酶活力之比称为相对活力；一般用百分数表示。以游离酶以游离酶(或微生物或微生物)的活力为的活力为100作比较作比较 概念：概念：酶固定化以后，活性降低的原因：酶固定化以后，活性降低的原因：（1）酶蛋白空间构象改变，空间位阻效应增加，而酶的催化活性与其特定酶蛋白空间构象改变，空间位阻效应增加，而酶的催化活性与其特定的空间结构密切相关；尤其是共价结合法和交联法（酶的活性基团参的空间结构密切相关；尤其是共价结合法和交联法（酶的活性基团参与反应）对空间结构的影响更大与反应）对空间结构的影响更大（2）酶与载体偶联后产生的空间位阻效应降低了酶分子周围的底物浓度，减少酶与载体偶联后产生的空间位阻效应降低了酶分子周围的底物浓度，减少了酶与底物接触的机会；使反应减慢，表现出酶活力下降了酶与底物接触的机会；使反应减慢，表现出酶活力下降（3）包埋法中凝胶通透性的影响，使酶与底物的接触受到限制包埋法中凝胶通透性的影响，使酶与底物的接触受到限制 另外，有些固定化酶另外，有些固定化酶(或微生物或微生物)相对活力的大小，还会受到底物与载相对活力的大小，还会受到底物与载体性质体性质、酶的类型、酶量以及制备方法等因素的影响、酶的类型、酶量以及制备方法等因素的影响（二）活力曲线与最适（二）活力曲线与最适pHpH值值 l固定化酶固定化酶(或微生物或微生物)的活力曲线与最适的活力曲线与最适pHpH值的变化：值的变化：酶酶(或微生物或微生物)固定化后，其活力曲线和最适固定化后，其活力曲线和最适pHpH值，一般会发生偏移值，一般会发生偏移l活力曲线和最适活力曲线和最适pH值偏移的原因：值偏移的原因：酶固定化后，部分氨基酸侧链和酶分子的净电荷发生了改变，随之酶活酶固定化后，部分氨基酸侧链和酶分子的净电荷发生了改变，随之酶活性基团的解离值性基团的解离值(pK)也改变；而酶的活性与其解离状态相关；也改变；而酶的活性与其解离状态相关；由于载体的理化性质受到影响，致使固定化酶颗粒扩散层内外的由于载体的理化性质受到影响，致使固定化酶颗粒扩散层内外的H+浓浓度产生差异，其中多阴离子衍生物载体带负电荷，最适度产生差异，其中多阴离子衍生物载体带负电荷，最适pH值向碱侧偏移，值向碱侧偏移，而多阳离子衍生物载体带正电荷，最适而多阳离子衍生物载体带正电荷，最适pH值则向酸侧偏移值则向酸侧偏移；酶反应产物导致固定化酶颗粒内带电微环境的改变（在大多数情况下，酶反应产物导致固定化酶颗粒内带电微环境的改变（在大多数情况下，固定化酶的活力曲线要比游离酶陡峭）固定化酶的活力曲线要比游离酶陡峭）的解释：的解释：在固定化酶反应体系中，酶颗粒周围存在一个极薄的扩在固定化酶反应体系中，酶颗粒周围存在一个极薄的扩散层，带电的载体使固定化酶微环境中的带电状态不同与散层，带电的载体使固定化酶微环境中的带电状态不同与外环境。带负电荷的载体会使料液中外环境。带负电荷的载体会使料液中H+局部集中于扩散层，局部集中于扩散层，使固定化酶微环境的使固定化酶微环境的PH值低于外侧料液的值低于外侧料液的PH值；为了抵值；为了抵消这种影响，需提高料液的消这种影响，需提高料液的PH值，才能使固定化酶达到最值，才能使固定化酶达到最大的催化速度；所以，带负电荷的载体通常使固定化酶的大的催化速度；所以，带负电荷的载体通常使固定化酶的最适最适PH值向碱侧偏移，而带正电荷的载体则通常使固定化值向碱侧偏移，而带正电荷的载体则通常使固定化酶的最适酶的最适PH值向酸侧偏移值向酸侧偏移l活力曲线和最适活力曲线和最适pHpH值偏移的表现值偏移的表现 综上情况可以看出，酶综上情况可以看出，酶(或微生物或微生物)经固定化后，其活力曲线和最适经固定化后，其活力曲线和最适pHpH的变化是有一定规律的。因此，当酶的最适的变化是有一定规律的。因此，当酶的最适pHpH与其所处的环境与其所处的环境pHpH不不相同时，可通过选择适当的载体进行固定，以改变其最适相同时，可通过选择适当的载体进行固定，以改变其最适p p值，使之与值，使之与环境相一致，从而使固定化酶活力达到最大。环境相一致，从而使固定化酶活力达到最大。l特点：特点：固定化酶的稳定性一般都优于游离酶但是，也有的酶在固定固定化酶的稳定性一般都优于游离酶但是，也有的酶在固定化后，稳定性降低了。化后，稳定性降低了。固定化微生物的稳定性，基本上与固定化酶相近。固定化微生物的稳定性，基本上与固定化酶相近。l固定化酶稳定性提高的原因可能是：固定化酶稳定性提高的原因可能是：带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间构象起到稳定作用构象起到稳定作用蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机溶剂等对酶的进攻破坏溶剂等对酶的进攻破坏 作用作用（三）稳定性（三）稳定性（四）米氏常数（四）米氏常数米氏常数（米氏常数（K m）是酶的一个特征性常数是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的，每一种酶都有一定的K m 值，值，其倒数其倒数1/K m 称为亲和常数，称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力用来表示酶与底物的亲和力；而固定化酶；而固定化酶的的K m 值和最大反应速度（值和最大反应速度（Vm）常因酶蛋白结构的变化和载体带电荷的常因酶蛋白结构的变化和载体带电荷的影响而变化。影响而变化。此外，此外，随着反应体系离子强度的增大，或者载体粒度的增大，米氏常随着反应体系离子强度的增大，或者载体粒度的增大，米氏常数也会增大数也会增大。一般，载体的颗粒越小，固定化酶越接近游离状态的酶，。一般，载体的颗粒越小，固定化酶越接近游离状态的酶，米氏常数就越接近。米氏常数就越接近。固定化酶的最大反应速度与游离酶相比固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数，要依具体情况而定。大多数酶经固定化以后，酶经固定化以后，Vm 变化不大变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异，但也有由于固定化方法不同而有差异的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm 与游离酶相同；与游离酶相同；但用但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其凝胶包埋的转化酶，其Vm却只却只 相当于游离酶的相当于游离酶的1/10。（五）其（五）其 他他1 1、PHPH值的影响：酶用带负电荷的载体固定时，在偏酸性环境条值的影响：酶用带负电荷的载体固定时，在偏酸性环境条件下可增加固定化酶的稳定性；相反，酶用带负电荷的载体固件下可增加固定化酶的稳定性；相反，酶用带负电荷的载体固定时，在偏碱性环境条件下可增加固定化酶的稳定性定时，在偏碱性环境条件下可增加固定化酶的稳定性2 2、酶固定化以后，抗氧化能力增强、酶固定化以后，抗氧化能力增强3 3、固定化微生物，如含精氨酸脱亚胺酶的恶臭假单包菌，用、固定化微生物，如含精氨酸脱亚胺酶的恶臭假单包菌，用PEAEPEAE凝胶包埋后，由于细胞膜结构发生改变，导致起对底物凝胶包埋后，由于细胞膜结构发生改变，导致起对底物（S S）和产物（和产物（P P）的选择性丧失，从而提高了固定化微生物的的选择性丧失，从而提高了固定化微生物的相对活力相对活力六、应用六、应用 固固定定化化酶酶(或或微微生生物物)比比游游离离酶酶(或或自自然然微微生生物物)不不但但稳稳定定性性好好，而而且且与与底底物物和和产产物物更更容容易易分分开开，所所以以在在工工业业、医学、药学和生化分析等方面的应用发展较快医学、药学和生化分析等方面的应用发展较快 （一）工业方面应用（一）工业方面应用 由于酶固定化以后，既稳定，又容易与由于酶固定化以后，既稳定，又容易与S S和和P P分离，分离，并且可以重复使用；所以固定化酶在工业上的应用既并且可以重复使用；所以固定化酶在工业上的应用既经济又实用经济又实用例例1、L-氨基酸的生产是利用固定化氨基酰化酶反应进行的氨基酸的生产是利用固定化氨基酰化酶反应进行的生产步骤：生产步骤：先将氨基酰化酶先将氨基酰化酶吸附于吸附于DEAE-交联葡聚糖交联葡聚糖A-25，制成固定化制成固定化酶反应柱，在柱中通入酶反应柱，在柱中通入DL-氨基酸的氨基酸的N-酰化衍生物，然后采酰化衍生物，然后采用溶解度法把用溶解度法把L-氨基酸和酰化氨基酸和酰化-D-氨基酸分开氨基酸分开（这样就得到（这样就得到了光学纯度好，回首率高的了光学纯度好，回首率高的DL-氨基酸）氨基酸）例例2、利用固定化多酶反应柱生利用固定化多酶反应柱生产产3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 多酶反应柱，从上到下依次分别为用多酶反应柱，从上到下依次分别为用聚丙烯酰胺凝胶包埋的己糖激酶、磷酸己聚丙烯酰胺凝胶包埋的己糖激酶、磷酸己糖异构酶、糖异构酶、6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-1、醛缩酶、醛缩酶（裂解酶）。当向反应柱注入一定比例的（裂解酶）。当向反应柱注入一定比例的G、ATP、Mg 2+混合时，这些底物原料混合时，这些底物原料流经反应柱时，依次被己糖激酶、磷酸己流经反应柱时，依次被己糖激酶、磷酸己糖异构酶、糖异构酶、6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-1和醛缩酶催和醛缩酶催化反应，生成化反应，生成3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛（二）医学方面（二）医学方面 固定化酶在医学方面的应用，目固定化酶在医学方面的应用，目前正在积极的研究和开发。其中用包前正在积极的研究和开发。其中用包埋法制备的固定化酶，在治疗酶缺乏埋法制备的固定化酶，在治疗酶缺乏症和代谢异常症等疾病时，有很好的症和代谢异常症等疾病时，有很好的发展前景。发展前景。例例1 在小白鼠腹腔内，分别注射在小白鼠腹腔内，分别注射生理盐水、游离的和固定化的天冬酰生理盐水、游离的和固定化的天冬酰胺酶后，饲养观察的结果如图胺酶后，饲养观察的结果如图10-8所所示示 从图中可看出：使用游离从图中可看出：使用游离天冬酰胺酶的药效时间为天冬酰胺酶的药效时间为2天，天，而使用固定化天冬酰胺酶的药而使用固定化天冬酰胺酶的药效时间为效时间为6天，明显延长了药效天，明显延长了药效时间时间 机体正常的体细胞能合成足量的机体正常的体细胞能合成足量的Asn 供蛋白质合成供蛋白质合成使用，但白血病病变细胞却不能合成使用，但白血病病变细胞却不能合成Asn，必须不断必须不断从血液中摄取从血液中摄取Asn供病变细胞蛋白质合成。因此，临供病变细胞蛋白质合成。因此，临床上应用天冬酰胺酶使床上应用天冬酰胺酶使Asn水解为水解为Asp，减少血液减少血液Asn的含量，使病变细胞蛋白质合成受阻，达到治疗的含量，使病变细胞蛋白质合成受阻，达到治疗的目的的目的例例2 人工肾便人工肾便 尿毒症患者就是由于肾脏病变，体内的代谢废物如尿尿毒症患者就是由于肾脏病变，体内的代谢废物如尿素、尿酸等不能随尿排出体外，传统的方法就是素、尿酸等不能随尿排出体外，传统的方法就是“透析透析”，即利用半透膜将血液中的代谢废物排除。这种方法病人，即利用半透膜将血液中的代谢废物排除。这种方法病人很痛苦，使用不方便，并且成本很高；而很痛苦，使用不方便，并且成本很高；而新型新型人工肾人工肾是由是由微型胶囊脲酶和微型胶囊吸附剂微型胶囊脲酶和微型胶囊吸附剂离子交换树脂或活性炭离子交换树脂或活性炭构成的，将其装于体外血管分流器内，并与循环系统连接，构成的，将其装于体外血管分流器内，并与循环系统连接，体积约为体积约为1立升，可随身携带。并且由于固定化酶可重复立升，可随身携带。并且由于固定化酶可重复使用，离子交换树脂可再生，所以此法比透析法效率高、使用，离子交换树脂可再生，所以此法比透析法效率高、成本低、使用方便成本低、使用方便（三）生化分析方面（三）生化分析方面 1定量分析定量分析 定量分析是将固定化酶分别与分光光度计、荧光光度计和微量热量计等仪定量分析是将固定化酶分别与分光光度计、荧光光度计和微量热量计等仪器组合起来，进行含量检测的一种自动分析方法。目前这种分析方法正在临床器组合起来，进行含量检测的一种自动分析方法。目前这种分析方法正在临床检验中应用。检验中应用。例如，例如，在固定化胆碱酯酶中，通人一定体积的空气或水，根据荧光分析测在固定化胆碱酯酶中，通人一定体积的空气或水，根据荧光分析测定结果，便可得知其中对人有害的胆碱酯酶神经毒剂定结果，便可得知其中对人有害的胆碱酯酶神经毒剂(酶抑制剂酶抑制剂)的含量的含量 现在国际上已用固定化酶对体液和排泄物中的过氧化氢、尿素、乳酸、葡现在国际上已用固定化酶对体液和排泄物中的过氧化氢、尿素、乳酸、葡葡糖和氨基酸等物质进行自动分析测定葡糖和氨基酸等物质进行自动分析测定(见表见表10-6)。2 2制作酶电极制作酶电极 将固定化酶覆盖在电极上，或将酶固定在电极上构成的将固定化酶覆盖在电极上，或将酶固定在电极上构成的装置称酶电极，也称酶传感器装置称酶电极，也称酶传感器 3 3分析物质的结构分析物质的结构 将分析蛋白质和核酸一级结构的蛋白水解酶、羧肽酶、将分析蛋白质和核酸一级结构的蛋白水解酶、羧肽酶、亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸单酯酶等分别亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸单酯酶等分别制成固定化酶，在应用时比游离酶操作简单，分离方便制成固定化酶，在应用时比游离酶操作简单，分离方便4 4研究酶的功能和反应机理研究酶的功能和反应机理 采用固定化酶可以研究酶的功能和反应机理采用固定化酶可以研究酶的功能和反应机理例如例如 为了研究某些酶的为了研究某些酶的亚单位功能，可将具有亚单位功能，可将具有4个亚基的醛缩酶固定到琼个亚基的醛缩酶固定到琼脂糖上，制成固定化的醛脂糖上，制成固定化的醛缩酶缩酶(s)。将此酶经含巯基。将此酶经含巯基乙醇的乙醇的8molL尿素溶液尿素溶液处理后，得到变性的固定处理后，得到变性的固定化亚单位化亚单位(b)。然后经透析。然后经透析和再生，则分别得到了固和再生，则分别得到了固定化亚单位定化亚单位(c)和再生固定和再生固定化醛缩酶化醛缩酶(d)(见图见图10-9)。(a)、(c)和和(d)三者的比活三者的比活力分别为力分别为4.5、1.6和和2.2umg蛋白。这表明构成蛋白。这表明构成醛缩酶的亚基醛缩酶的亚基(即亚单位即亚单位)是有酶活性是有酶活性5制备亲和吸附剂制备亲和吸附剂 有些物质如酶和底物有些物质如酶和底物(或竞争性抑制剂或竞争性抑制剂)、抗原和抗体、抗原和抗体、激素和受体蛋白、激素和受体蛋白、DNA和和RNA等具有某些生物学特性，等具有某些生物学特性，即每一对物质之间存在着很高的特异结合能力。如果将即每一对物质之间存在着很高的特异结合能力。如果将酶用适当的载体固定后，制成的酶用适当的载体固定后，制成的亲和吸附剂亲和吸附剂就能把类似就能把类似底物底物从混合物中分离出来从混合物中分离出来。（四）应用实例（四）应用实例固定化固定化5 5-磷酸二酯酶的制备磷酸二酯酶的制备(重氮法重氮法)材料准备材料准备酶固定化酶固定化酶活力测定酶活力测定粗酶液的制备粗酶液的制备双功能试剂双功能试剂SESA（对对-硫酸酯乙砜基苯胺硫酸酯乙砜基苯胺）的配制）的配制载体（载体（葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200）的制备）的制备载体的活化（制备载体的活化（制备SESA葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200载体载体）原酶液活力测定原酶液活力测定 固定化酶活力测定固定化酶活力测定 残留酶活力测定残留酶活力测定相对酶活力和回收率的计算相对酶活力和回收率的计算 1 1、粗酶液、粗酶液制备制备 将将桔桔青青霉霉菌菌(Penicillium citrium)发发酵酵液液用用（NHNH4 4）2 2SOSO4 4盐盐析析，或用的冷乙醇沉淀分离得到酶或用的冷乙醇沉淀分离得到酶2、双功能试剂的预处理、双功能试剂的预处理 取取5g SESA（对对-硫酸酯乙砜基苯胺）硫酸酯乙砜基苯胺）加加10ml水研磨，水研磨，随后慢慢加入含随后慢慢加入含2NaNa2 2COCO3 3的的0.1molL的的NaOHNaOH溶液溶液40ml混匀，混匀，收集悬液，弃去残渣。收集悬液，弃去残渣。3、载体的处理、载体的处理取取10g SephadexSephadexG-200(粉末状粉末状150-200目目)凝胶凝胶，加水加水200mi浸浸泡泡12h后，加含后，加含2 NaNa2 2COCO3 3的的0.1molL NaOH溶液，室温溶液，室温放置过夜，使其充分溶胀放置过夜，使其充分溶胀4、载体的活化、载体的活化 将溶胀好的碱性将溶胀好的碱性SephadexSephadexG-200凝胶置沸水浴中搅拌，当加温凝胶置沸水浴中搅拌，当加温到到50时，逐渐加入时，逐渐加入SESA悬液，用含悬液，用含2 NaNa2 2COCO3 3的的0.1molL NaOH溶液调溶液调pH值为值为8，待加温到，待加温到80时，保持时，保持20min，尔后尔后继续加温到继续加温到90，维持，维持6min，接着开始降温冷却，并依次用接着开始降温冷却，并依次用0.1molL NaOH和和0.1molL HCLHCL溶液各溶液各700ml，洗洗3次，再次，再用水洗至用水洗至pH4.0左右左右 5、酶固定化、酶固定化取上述取上述SESA-SephadexSephadexG-200载体载体2g(离心后湿重离心后湿重)于冰浴中冷却，加于冰浴中冷却，加5 NaNa2 2NONO2 2溶液溶液05ml，搅匀并滴加搅匀并滴加1molL HCL HCL 05ml，搅拌搅拌10min后，后，用冷的用冷的0.05N HCLHCL洗三次，冷水洗一次。在洗三次，冷水洗一次。在05用用1molL NaNa2 2COCO3 3溶溶液液调调pH6.07.0，立即加入酶液立即加入酶液lml（10mg/ml）,合并洗涤液，用作测定合并洗涤液，用作测定残留的酶活力（固定化的残留的酶活力（固定化的5-5-磷酸二酯酶呈鲜艳的桔红色。按此程序，磷酸二酯酶呈鲜艳的桔红色。按此程序，用用2020mlml酶酸液可制成酶酸液可制成3939g g固定化酶，并得到固定化酶，并得到7474mlml固定化酶的洗涤液固定化酶的洗涤液 ）6、酶活力的测定、酶活力的测定取取洁洁净净试试管管，加加入入0.125molL乙乙酸酸缓缓冲冲液液(pH5.1)1.9ml(内内含含1酵酵母母RNA和和1mmolL ZnSO4)，67预预热热5min，加加酶酶液液(稀稀释释10倍倍)0.1ml(即即反反应应总总体体积积20ml)；反反应应15min，加加0.25钼钼酸酸铵铵-2.5过过氯氯酸酸试试剂剂2ml终终止止反反应应。置置水水浴浴l0min，使使其其(产产物物)沉沉淀淀完完全全，离离心心(2000rmin)l0min，取取上上清清液液0.2ml，加加水水9.8ml，摇摇匀匀；以以先先加加反反应应终终止止剂剂，后后加加酶酶液液同同法法制制成成的的溶溶液液作作为为空空白白对对照照，于于 260测测得得消消光值光值A260=0.555。然后计算原酶活力。然后计算原酶活力 （1）原酶液活力测定）原酶液活力测定(20ml)注意：注意：A260=反应前的反应前的A260-反应后的反应后的A260 酶活性单位：酶活性单位：在规定条件下，每分钟催化在规定条件下，每分钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶底物转化为产物所需的酶量为一量为一 个个IU（讲义上是：在讲义上是：在规定的反应条件下，每分钟使消规定的反应条件下，每分钟使消光值增加光值增加1.0 所需的酶量称为一个酶单位）所需的酶量称为一个酶单位）酶活力单位计算公式为酶活力单位计算公式为:比色液稀释倍数总体积原酶液总活力单位（原酶液总活力单位（）=5020 =14800（2）固定化酶活力测定）固定化酶活力测定 取底物溶液取底物溶液20ml置烧杯中，置烧杯中，67预热预热5min，加固定化酶加固定化酶0.50g(滤纸滤纸吸干吸干)反应反应15min，立即过滤，取滤液立即过滤，取滤液2ml，加水加水9898ml,ml,然后同上法测定然后同上法测定 260处的消光值为处的消光值为A260=0.605，计算固定化酶总活力单位。，计算固定化酶总活力单位。固定化酶总活力单位（固定化酶总活力单位（b）=5039=6286.2 取取0.2ml洗洗涤涤液液，不不加加稀稀释释（因因为为洗洗涤涤液液中中酶酶的的含含量量比比较较稀稀）直直接接加加入入反反应应，按按上上述述程程序序进进行行测测定定，测测得得A260为为0.245。（3 3）残留酶）残留酶(74ml未偶联部分未偶联部分)活力测定活力测定 洗涤液总酶活力单位洗涤液总酶活力单位 (c)=5074=1206.2（4 4）相对酶活力和回收率）相对酶活力和回收率 计算计算固定化酶活力占实际偶联到固定化载体上酶活力的百分数固定化酶活力占实际偶联到固定化载体上酶活力的百分数 相对酶活力相对酶活力固定化酶活力占原酶液总活力的百分数固定化酶活力占原酶液总活力的百分数 回回 收收 率率相对酶活力相对酶活力=100%=47%回收率回收率=100%=100%=100%=43%