液相色谱的柱和系统故障检修.pptx

2024/8/9 周五1六、六、色谱柱和色谱系统的故障检修色谱柱和色谱系统的故障检修l每个每个HPLC使用者应该知道什么使用者应该知道什么 2024/8/9 周五2HPLC 的组成的组成l泵泵l进样器进样器/自动进样器自动进样器l色谱柱色谱柱l检测器检测器l数据系统数据系统/积分仪表积分仪表l所有这些部件可能出现故障而需要检修。所有这些部件可能出现故障而需要检修。2024/8/9 周五3HPLC 的组成的组成2024/8/9 周五4色谱柱问题的类型色谱柱问题的类型l l A.压力压力l B.峰形峰形l C.保留时间保留时间2024/8/9 周五5A压力问题压力问题 l色谱柱观测色谱柱观测 潜在的问题潜在的问题 l压力高压力高 堵塞滤头堵塞滤头l 色谱柱污染色谱柱污染l 堵塞填料堵塞填料2024/8/9 周五6查出原因查出原因 纠正压力纠正压力l有无柱子时检查压力有无柱子时检查压力 去柱后去柱后 去柱前去柱前 去预柱去预柱.许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞l如果柱压高如果柱压高:l冲洗柱子冲洗柱子:排除柱污染和填料堵塞排除柱污染和填料堵塞l 包括：高分子量被吸附化合物包括：高分子量被吸附化合物l 样品或缓冲液中的沉淀物样品或缓冲液中的沉淀物l反冲柱子清洁阻塞的滤头反冲柱子清洁阻塞的滤头l更换滤头更换滤头2024/8/9 周五7Column Cleaning 柱子清洗l用比你的流动相更强的溶剂冲洗l为了增加强度选择反相溶剂 对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 冲洗l没有缓冲盐的流动相l100%Methanol 甲醇l100%Acetonitrile 乙腈l75%Acetonitrile:25%Isopropanol 75%乙腈：25异丙醇l100%Isopropanol 异丙醇l100%Methylene Chloride 二氯甲烷l100%Hexane 已烷l当用已烷蔌二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相2024/8/9 周五8柱子清洗柱子清洗l为了增加强度选用正相溶剂为了增加强度选用正相溶剂l或：或：每种溶剂至少用每种溶剂至少用50 ml l 50%甲醇甲醇:50%氯仿氯仿l 乙酸乙酯乙酸乙酯2024/8/9 周五9怎样更换滤头怎样更换滤头l柱进口滤头柱进口滤头l戴手套戴手套l不要让底座干燥不要让底座干燥l不要使柱身受热不要使柱身受热,否则填料会喷出否则填料会喷出l不要旋得太紧不要旋得太紧l旋好尾端螺母旋好尾端螺母l旋好尾端螺头旋好尾端螺头2024/8/9 周五10压力问题的预防压力问题的预防l柱保护柱保护 保护柱保护柱/预柱预柱l在线过滤器在线过滤器l样品预处理样品预处理l适当的柱冲洗适当的柱冲洗l过滤缓冲流动相过滤缓冲流动相2024/8/9 周五11 压力问题的预防压力问题的预防:在线装置在线装置lMobile Phase Pre-Column Injector Filter GuardlFrom Pump 预柱预柱 进样器进样器 滤头滤头 Columnl从泵来的流动相从泵来的流动相 保护柱保护柱 l Analyticall ColumnlFilter and Guard Column Act on Sample 分析柱分析柱l 滤头和保护柱作用于样品滤头和保护柱作用于样品l Pre-Column Acts on Mobile Phasel 预柱作用于流动相预柱作用于流动相 To Detectorl 到检测器到检测器2024/8/9 周五12压力问题的预防压力问题的预防:样品制备样品制备l溶剂溶剂/化学环境化学环境l微粒微粒/凝聚物的除去凝聚物的除去 Filter samples 过滤样品过滤样品 Centrifugation 离心分离离心分离 固相萃取固相萃取 薄层板薄层板 生物膜生物膜2024/8/9 周五13B峰形问题峰形问题l Split peaks 裂峰裂峰l Peak tailing 峰拖尾峰拖尾l Broad peaks 宽峰宽峰lPoor efficiency 低柱效低柱效l许多峰形问题是结合在一起的许多峰形问题是结合在一起的-例如例如:l展宽和拖尾或拖尾和保留时间增加展宽和拖尾或拖尾和保留时间增加2024/8/9 周五14裂峰裂峰l可能的原因可能的原因:Column contamination 柱污染柱污染 Partially plugged frit 部分阻塞滤片部分阻塞滤片 Column void 柱头塌陷柱头塌陷 Injection solvent effects 溶剂效应溶剂效应2024/8/9 周五15裂峰裂峰柱污染柱污染lColumn:StableBond SB-C8,4.6 250mm,5mlMobile Phase:60%25mM Na2HPO4,pH3.0:40%MeOHlFlow Rate:1.0 mL/min Temperature:35ClDetection:UV 254 nmlSample:1.Pseudoephedrine 2.APAP 3.Unknown l4.ChlorpheniraminelInjection 1 峰峰3 峰形较好峰形较好lInjection 30 峰峰3 裂峰裂峰lInjection 1 After Column Wash with 100%CANl经经100%乙腈冲洗后乙腈冲洗后 峰峰3 峰形极好峰形极好2024/8/9 周五16裂峰裂峰溶剂化效应溶剂化效应lColumn:StableBond SB-C8,4.6 250mm,5mlMobile Phase:82%H2O:18%ACNlInjection Volume:30 L lSample:l1.Caffeine 咖啡因咖啡因 2.Salicylamide 水杨酰胺水杨酰胺lA.Injection Solvent B.Injection Solventl 100%Acetonitrile Mobile Phasel 峰形宽拖尾峰形宽拖尾 峰形尖锐对称峰形尖锐对称l样品溶剂尽可能与流动相匹配样品溶剂尽可能与流动相匹配 2024/8/9 周五17 裂峰原因的确定裂峰原因的确定l复杂样品的基质或分析许多样品复杂样品的基质或分析许多样品 -柱污染或部分阻塞滤片柱污染或部分阻塞滤片 l流动相流动相 pH=7 -由于硅胶溶解使柱塌陷由于硅胶溶解使柱塌陷(除非使用专门的柱子除非使用专门的柱子)-预柱与柱的塌陷预柱与柱的塌陷l样品的量大样品的量大 -裂峰和宽峰裂峰和宽峰,由样品量来决定由样品量来决定 2024/8/9 周五18峰拖尾、变宽和柱效降低峰拖尾、变宽和柱效降低可能的原因可能的原因l l柱柱“次级效应次级效应”（硅醇基效应）（硅醇基效应）l柱塌陷柱塌陷l柱污染柱污染l柱老化柱老化l柱负荷超载柱负荷超载l柱外效应柱外效应2024/8/9 周五19峰拖尾柱峰拖尾柱“次级效应次级效应”（扫尾剂）（扫尾剂）lColumn:Alkyl-C8,4.6 150mm,5mlMobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0:15%ACNlFlow Rate:1.0 mL/min Temperature:35ClSample:1.Phenylpropanolamine 苯丙醇胺去甲麻黄碱苯丙醇胺去甲麻黄碱 l2.Ephedrine 麻黄碱麻黄碱 3.Amphetamine 安非他明苯丙胺安非他明苯丙胺l4.Methamphetamine 脱氧麻黄碱脱氧麻黄碱 5.Phenteramine 苯三胺苯三胺lNo TEA 无三乙胺无三乙胺 10 mM TEA 10 mM 三乙胺三乙胺lUSP TF(5%)美国药典拖尾因子美国药典拖尾因子 USP TF(5%)美国药典拖尾因子美国药典拖尾因子l1.1.29 1.1.19l2.1.91 2.1.18 l3.1.63 3.1.20l4.2.35 4.1.26l5.1.57 5.1.14l用流动相减尾剂用流动相减尾剂(三乙胺三乙胺)在在pH 7 消除峰拖尾消除峰拖尾2024/8/9 周五20峰拖尾柱峰拖尾柱“次级效应次级效应”（PH值）值）lColumn:Alkyl-C8,4.6 150mm,5mlMobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0:15%ACNlFlow Rate:1.0 mL/min Temperature:35ClSample:1.Phenylpropanolamine 苯丙醇胺去甲麻黄碱苯丙醇胺去甲麻黄碱 l2.Ephedrine 麻黄碱麻黄碱 3.Amphetamine 安非他明苯丙胺安非他明苯丙胺l4.Methamphetamine 脱氧麻黄碱脱氧麻黄碱 5.Phenteramine 苯三胺苯三胺l pH 3.0 pH 7.0 lUSP TF(5%)美国药典拖尾因子美国药典拖尾因子 USP TF(5%)美国药典拖尾因子美国药典拖尾因子l4.脱氧麻黄碱脱氧麻黄碱 1.33 4.脱氧麻黄碱脱氧麻黄碱 2.35l降低流动相的降低流动相的pH,减小与硅醇基作用引起的峰拖尾减小与硅醇基作用引起的峰拖尾2024/8/9 周五21峰拖尾峰拖尾柱污染柱污染lColumn:StableBond SB-C8,4.6 250mm,5mlMobile Phase:20%H2O:80%MeOH Flow Rate:1.0 mL/min Temperature:R.T.Detection:UV 254 nmlSample:1.Uracil 尿嘧啶尿嘧啶 2.Phenol 苯酚苯酚 l 3.4-Chloronitrobenzene 4-氯硝基苯氯硝基苯 4.Toluene 甲苯甲苯lPlates TF Plates TF Plates TFl理论板数理论板数 拖尾因子拖尾因子 理论板数理论板数 拖尾因子拖尾因子 理论板数理论板数 拖尾因子拖尾因子l1.7629 2.08 1.7906 1.43 1.7448 1.06l2.12043 1.64 2.12443 1.21 2.12237 1.21l3.13727 1.69 3.17999 1.19 3.15366 1.11l4.13355 1.32 4.17098 1.25 4.19067 1.17lQC test forward direction QC test reverse direction QC test after cleaning l 100%IPA,35C l 向前方向向前方向 相反方向相反方向 100%异丙醇冲洗后异丙醇冲洗后2024/8/9 周五22峰拖尾峰拖尾/变宽变宽样品过载效应样品过载效应lColumn:4.6 150mm,5mlMobile Phase:40%25mM Na2HPO4,pH7.0:60%ACNlFlow Rate:1.5 mL/min Temperature:40ClSample:l1.Desipramine 去郁敏去郁敏/脱甲基丙米嗪脱甲基丙米嗪 2.Nortriptyline 3.Doxepin 4.Imipramine 丙米嗪丙米嗪 5.Amitriptyline 阿米替林阿米替林 6.Trimipramine2024/8/9 周五23峰拖尾峰拖尾/变宽变宽样品过载效应样品过载效应lUSP TF 拖尾因子拖尾因子 Plates 理论板数理论板数 lHigh Load /10 Low Load High Load /10 Low Loadl高载负高载负/10倍倍 低载负低载负 高载负高载负/10倍倍 低载负低载负l1.1.60 1.70 850 5941l2.2.00 1.90 815 7842l3.1.56 1.56 2776 6231 l4.2.13 1.70 2539 8359 l5.2.15 1.86 2735 10022 l6.1.25 1.25 5189 10725 2024/8/9 周五24 峰变宽峰变宽,裂开裂开 柱塌陷（柱塌陷（pH）lMobile Phase:流动相：流动相：l50%CAN:50%Water:0.2%TEA (pH 11)l50乙腈乙腈:50水水:0。2三乙胺三乙胺 (pH 11)l After 30 injections Initial 开始时开始时 l 进样进样30次后次后l多数峰形改变可能是同一柱问题引起的。在这个例多数峰形改变可能是同一柱问题引起的。在这个例子中，高子中，高pH溶解硅胶导致塌陷溶解硅胶导致塌陷2024/8/9 周五25峰变宽峰变宽,裂开裂开 柱塌陷（柱塌陷（迟到的峰迟到的峰）lColumn:Extend-C18,4.6 150 mm,5 mlMobile Phase:40%10 mM TEA,pH 11:60%MeOHlFlow Rate:1.0 mL/min Temperature:R.T.Detection:UV 254lSample:1.Maleat 顺丁烯二酸顺丁烯二酸 2.Pseudeophedrine 伪伪麻黄碱麻黄碱 3.Chlorphenniramine 氯非尼拉明氯非尼拉明理论板数理论板数极低的理论板数表明这是一个前面进样极迟洗脱出来的极低的理论板数表明这是一个前面进样极迟洗脱出来的峰峰2024/8/9 周五26峰拖尾峰拖尾 进样器密封性差进样器密封性差lColumn:Bonus-RP,4.6 75mm,3.5mlMobile Phase:30%H2O:70%MeOH Flow Rate:1.0 mL/min Temperature:R.T.Detection:UV 254 nmlSample:1.Uracil 尿嘧啶尿嘧啶 2.Phenol 苯酚苯酚 l 3.N,N-Dimethylaniline N,N-二甲苯胺二甲苯胺lPlates TF Plates TF l理论板数理论板数 拖尾因子拖尾因子 理论板数理论板数 拖尾因子拖尾因子 l1.2235 1.72 1.3670 1.45l2.3491 1.48 2.10457 1.09 l3.5432 1.15 3.10085 1.00 l之前之前 转动杆和隔离密封垫检修后转动杆和隔离密封垫检修后仪器保养超期可能引起峰形问题仪器保养超期可能引起峰形问题/进样器划痕进样器划痕2024/8/9 周五27峰拖尾原因的确定峰拖尾原因的确定l流动相流动相l评价柱选择评价柱选择 l减小进样量减小进样量l消除柱外效应消除柱外效应l冲洗柱子检查柱子老化冲洗柱子检查柱子老化/塌陷塌陷2024/8/9 周五28C保留时间问题保留时间问题l保留时间改变保留时间改变l容量因子改变容量因子改变l选择性改变选择性改变 2024/8/9 周五29相同柱子上保留时间改变相同柱子上保留时间改变,超时超时l可能的原因可能的原因:l柱老化柱老化l柱污染柱污染l不够平衡不够平衡l柱柱/流动相组成差流动相组成差l改变流动相改变流动相l改变流速改变流速l其他仪器问题其他仪器问题 2024/8/9 周五30流动相改变引起保留时间改变流动相改变引起保留时间改变l60%MeOH:40%0.1%TFA Fresh TFA Added to Mobile PhaselVolatile TFA evaporated/degassed from mobile phase.易挥发的三氟乙酸从流动相中蒸发易挥发的三氟乙酸从流动相中蒸发/挥发。挥发。lReplacing it solved problem.换换用新的流动相就解决问题。用新的流动相就解决问题。l使用有机挥发性酸时，流动相应新配。使用有机挥发性酸时，流动相应新配。柱老化平衡不够引起保留时间选择性改变柱老化平衡不够引起保留时间选择性改变2024/8/9 周五31结论结论l高效液相色谱柱问题明显的为高效液相色谱柱问题明显的为:lHigh pressure 高压高压lUndesirable peak shape 不希望得到的峰形不希望得到的峰形lChanges in retention/selectivity 保留时间保留时间/选择性的改变选择性的改变 lOften these problems are not associated with the column and may be caused by instrument and experimental condition issues.l经常遇到的这些问题不一定与柱有关经常遇到的这些问题不一定与柱有关,而与仪器和而与仪器和实验条件方面的问题有关实验条件方面的问题有关