目的基因的获得.pptx

第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得对于高等真核生物而言，于高等真核生物而言，基因基因组DNADNA十分十分庞大大,基因可达基因可达数万个，且基因数万个，且基因组成成结构复构复杂，除，除编码序列序列，还有有非非编码序列序列及及调控序列控序列，基因，基因间还存在大量的存在大量的间隔序列和重复序列，因此，隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例中所占的比例极其微小，除少数例外，外，绝大多数基因大多数基因难以直接分离得到。以直接分离得到。为了解决了解决这个个难题，一种可行的方法就是将，一种可行的方法就是将这个基因个基因扩增，增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是往往是未知基因未知基因，因此无法，因此无法对它它进行特异性行特异性扩增，而只能增，而只能对所所有的基因有的基因进行行扩增，也就是构建增，也就是构建该生物材料的基因文生物材料的基因文库，然后，然后再根据不同的方法将所需的克隆再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的出来，最后分离得到目的基因。基因。生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得基因文基因文库(gene library)概念概念又称又称DNA文文库，是指某个生物的基因，是指某个生物的基因组DNA或或cDNA片段与适当片段与适当的的载体在体外重体在体外重组后，后，转化宿主化宿主细胞，并通胞，并通过一定的一定的选择机制机制筛选后后得到大量的阳性菌落得到大量的阳性菌落(或噬菌体或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即，所有菌落或噬菌体的集合即为该生生物的基因文物的基因文库。按外源按外源DNA片段的来源分基因文片段的来源分基因文库分分为：基因基因组DNA文文库从特定从特定组织提取的染色体基因提取的染色体基因组DNAcDNA文文库mRNA反反转录成的成的cDNA拷拷贝基因文基因文库由由外源外源DNA片段片段、载体体和和宿主宿主组成。成。生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(一一)基因基因组DNA文文库的的类型型 根据所根据所选用的用的载体可以分体可以分为：质粒文粒文库噬菌体文噬菌体文库粘粒文粘粒文库人工染色体文人工染色体文库（细菌人工染色体文菌人工染色体文库、酵母人工染色体文、酵母人工染色体文库等）等）载体能够容载的载体能够容载的DNADNA片断大小片断大小直接影响到构建完整的基因文库所直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。需要的重组子的数目。载体系列：载体系列：容量为容量为 24 kp cosmid载体：载体容量为容量为 50 kb YAC：容量为容量为 1 Mb BAC:容量为容量为 300 kb生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建 用质粒载用质粒载体构建基因组文体构建基因组文库的流程库的流程该法简单、快该法简单、快速、易于操作，但速、易于操作，但仅适合一些低等真仅适合一些低等真核生物和原核生物核生物和原核生物。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用用噬菌体载体构建基因组文库的流程噬菌体载体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用用黏粒黏粒载体构建基因组文库的流程载体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(二二)基因基因组DNA文文库的的质量量标准准一个理想的基因一个理想的基因组DNA文文库应具具备下列条件：下列条件：重重组克隆的克隆的总数不宜数不宜过大，以减大，以减轻筛选工作的工作的压力。力。载体的装体的装载量最好大于基因的量最好大于基因的长度，避免基因被分隔度，避免基因被分隔克隆。克隆。克隆与克隆之克隆与克隆之间必必须存在足存在足够长度的重叠区域，以利度的重叠区域，以利克隆排序。克隆排序。克隆片段易于从克隆片段易于从载体分子上完整卸下。体分子上完整卸下。重重组克隆能克隆能稳定保存、定保存、扩增、增、筛选。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNA文文库构建的程序构建的程序 1.1.载体体DNADNA的制的制备；2.2.高高纯度度大大相相对分分子子质量量基基因因组DNADNA的的提提取取和和大大片片段段的的制制备；3.3.高高纯度度大大相相对分分子子质量量基基因因组DNADNA的的部部分分酶切切与与脉脉冲冲电泳分泳分级分离；分离；4.4.载体与外源片段的体与外源片段的连接与接与转化或侵染宿主化或侵染宿主细胞；胞；5.5.重重组克隆的挑克隆的挑选和保存。和保存。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序1载体体DNA片段的制片段的制备 DNA分离分离纯化化限制限制酶切切 脱磷酸化反脱磷酸化反应2供体供体DNA片段的制片段的制备总DNA分离分离纯化化物理切割法物理切割法超声波（超声波（300bp）或）或机械机械搅拌（拌（8kb）或或酶切法切法（内切（内切酶Sau3A进行局部消行局部消化。可得到化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。）分离特定大小分离特定大小DNA片段片段 超声波超声波300bp，剧烈烈搅拌：拌：8Kb 部分部分酶切切 完全完全酶切切 酶法分离特定大小分离特定大小DNADNA片段片段生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建DNADNA的不完全酶切的不完全酶切目的片段低熔点琼脂糖回收目的片段低熔点琼脂糖回收生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序3.3.载体与基因体与基因组DNA大片段的大片段的连接接直接直接连接、人工接接、人工接头或同聚物加尾。或同聚物加尾。（1）粘性末端直接粘性末端直接连接接：载体与外源体与外源DNA大片段的两个末端都有大片段的两个末端都有相同的粘性末端相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的的酶切末端。切末端。（2）人工接）人工接头法（法（adapter）人工合成的限制性内切人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。粘性末端片断。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序3.3.载体与基因体与基因组DNA大片段的大片段的连接接（3）同聚物加尾）同聚物加尾粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序4.重重组DNA转化受体化受体细胞胞（1）根据克隆）根据克隆载体的性体的性质选择合适的受体合适的受体细胞胞常常见的宿主的宿主细胞：胞：DH5:用于用于铺制与培养制与培养质粒平板和粘粒平板的重粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制缺陷型的抑制型菌株，可与型菌株，可与pUC编码的的 半乳糖苷半乳糖苷酶氨基端氨基端实现 互互补。HB101:用于大用于大规模制模制备质粒的抑制型菌株，粒的抑制型菌株，转化效率高化效率高JM101:可支持可支持带有琥珀突有琥珀突变载体生体生长的宿主菌的宿主菌JM109:支持支持带有琥珀突有琥珀突变载体生体生长的重的重组缺陷的抑制型菌缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启启动子子质粒粒载体体的宿主菌的宿主菌生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(四四)基因基因组文文库的大小的大小理理论值:基因基因组文文库的克隆数目基因的克隆数目基因组DNA总长/DNA插入插入片段的平均片段的平均长度。度。例如：例如：细菌基因菌基因组DNA总长度度=3 106kb 酶切后的切后的DNA片段平均片段平均长度度=15kb 基因基因组文文库的克隆数的克隆数=3 106kb/15kb=2 105个克个克隆隆生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(四四)基因基因组文文库的大小的大小（必（必须包括一定数量的重包括一定数量的重组子才可能克隆基因子才可能克隆基因组中的任中的任何碱基序列。）何碱基序列。）经验值：N基因基因组文文库克隆克隆总数数 P在基因在基因组文文库中目的基因中目的基因DNA片段的出片段的出现概率概率f插入片段大小与基因插入片段大小与基因组DNA大小比大小比值N =Ln(1 P)Ln(1 f)生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建 ln(1-0.99)ln1-(2104/4.6106)Nhuman=6.9 105 ln(1-0.99)ln1-(2 104/3 109)这个例子说明用质粒载体（插入片断这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。需要更大承载能力的载体。N E.coli=1.1 103For example:期望值为期望值为0.99，插入片断为，插入片断为20kb的的 E.coli(4.6106 bp)和和 human(3109 bp)基因组的克隆数的计算基因组的克隆数的计算生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建克隆片段克隆片段平均大小平均大小（bp）基因组大小基因组大小/bp2106（细菌）（细菌）2107（真菌）（真菌）2109（动物）（动物）理论克理论克隆数隆数实际克隆实际克隆数数理论克隆理论克隆数数实际克隆数实际克隆数理论克隆数理论克隆数实际克隆数实际克隆数5103400183140001841860000027631101010320091920009208300000138155020103100458100046031500006907744010350278500230075000345 386基因组文库应具有的克隆子数基因组文库应具有的克隆子数生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文文库的保存的保存1、影印膜影印膜滤保存法保存法生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文文库的保存的保存2.液体培养基中液体培养基中扩增保存增保存方法：从平板上挑取已方法：从平板上挑取已长出的克隆子出的克隆子转入含适当的抗生入含适当的抗生素培养基中混素培养基中，混 合的合的细菌生菌生长数代后，其培养物数代后，其培养物于于-70oC储存（加存（加终浓度度为25%的甘油）。的甘油）。缺点：因文缺点：因文库菌落生菌落生长的不均匀性而的不均匀性而导致文致文库中某些特中某些特定的序列定的序列过多或多或过少。少。生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文文库的保存的保存3.保存保存单个克隆子于含有甘油的培养基中个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合个克隆子接种于合 适的含抗生适的含抗生素的培养基中，菌体生素的培养基中，菌体生长到一定到一定浓度后，加入度后，加入终浓度度为25%的甘油，于的甘油，于-70 oC或或-25 oC下保下保存。存。缺点：需保存的克隆子数缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大多，工作量大生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 真核生物基因真核生物基因组DNA十分十分庞大，其复大，其复杂程度是蛋白程度是蛋白质和和mRNA的的100倍左右，而且含有大量的重复序列。倍左右，而且含有大量的重复序列。采用采用电泳分离和泳分离和杂交的方法，都交的方法，都难以直接分离到目的基因。以直接分离到目的基因。这是从染色体是从染色体DNA为出出发材料直接克隆目的基因的一个主要材料直接克隆目的基因的一个主要困困难。高等生物一般具有高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定种左右不同的基因，但在一定时间阶段的段的单个个细胞或个体中，都尽有胞或个体中，都尽有15%左右的基因得左右的基因得以表达，以表达，产生生约15000种不同的种不同的mRNA分子。可分子。可见，由，由mRNA出出发的的cDNA克隆，其复克隆，其复杂程度要比直接从基因程度要比直接从基因组克隆克隆简单得多。得多。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA以以mRNA为模板逆模板逆转录出的出的DNA称称cDNA。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 3 3 5 5 5 5 反转录酶反转录酶引物引物cDNA library利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA文文库的特点的特点（1）不含内含子序列。）不含内含子序列。（2）可以在）可以在细菌中直接表达（一般菌中直接表达（一般选用的用的载体都是表达型体都是表达型的）。的）。（3）包含了所有）包含了所有编码蛋白蛋白质的基因。的基因。（4）比）比DNA文文库小的多，容易构建。小的多，容易构建。cDNAcDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。文库既有种属特异性，也有组织特异性。基因特异性、基因特异性、器官特异性、器官特异性、代谢或发育特异性代谢或发育特异性生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 (一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤1.1.细胞胞总RNARNA的提取和的提取和mRNAmRNA的分离的分离2.2.第一条第一条cDNAcDNA合成合成3.3.第二条第二条cDNAcDNA合成合成4.4.双双链cDNAcDNA克隆克隆进质粒或噬菌体粒或噬菌体载体并体并导入宿主中入宿主中繁殖繁殖生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤1.总RNA（total RNA）提取和）提取和mRNA的分离的分离纯化化提取提取总RNA有商有商业化的化的试剂盒（盒（kit）。）。mRNA的分离的分离纯化化（1）原理）原理利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离等）中分离纯化。化。mRNA只占只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离的分离纯化化Column（柱）（柱）分离分离mRNA用商用商业化的化的Oligo dT纤维柱。柱。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤1.cDNA第一第一链合成合成逆逆转录酶能以能以RNA为模板合成模板合成DNA。用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一的第一链。反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOligo dTOligo dT引物引物生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建降解降解mRNAmRNA模板模板用用碱碱处理理或用或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的交分子中的mRNA。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAmRNAcDNAcDNA第一链第一链3 3 3 3 5 5 5 5 引物引物cDNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物或或RNaseHRNaseH碱碱生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤3.cDNA第二第二链合成（合成（自身引自身引导法和法和置置换合成法合成法）剩下的剩下的cDNA单链的的3末端一般形成一个弯回来的双末端一般形成一个弯回来的双链发卡卡结构（机理不明），可成构（机理不明），可成为合成第二条合成第二条cDNA链的引的引物。用物。用DNA聚合聚合酶合成第二合成第二链DNA。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建去掉去掉发卡卡结构构用用核酸核酸酶S1可以切掉可以切掉发卡卡结构（但构（但这会会导致致cDNA中有中有用的序列被切掉！）。用的序列被切掉！）。核酸酶核酸酶S1cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建1 1自身引导法自身引导法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建妙用妙用RNaseH这种种酶能能识别mRNA-cDNA杂交分子中的交分子中的mRNA，并，并将其降解成将其降解成许多小片断。多小片断。小片断正好成小片断正好成为DNA聚合聚合酶的引物，用来合成的引物，用来合成冈崎片崎片断。断。DNA Pol I除去引物并修除去引物并修补后再使用后再使用DNA连接接酶连成一成一整条整条DNA链。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建mRNAcDNA第一链第一链3 5 引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建置换合成法置换合成法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤4.cDNA与与载体体连接与接与转化受体化受体细胞胞同基因同基因组文文库相似相似生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建cDNA文文库构建的特殊方法构建的特殊方法OkayamaBerg法法OkayamaBerg改改进法法SMART(Switch Mechanism At the 5 end of RNA Templates)方法方法聚合聚合酶链式反式反应法（法（PCR法）法）生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建Okayama-Berg cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建OkayamaBerg改进法改进法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建PCR法构建法构建cDNA文库文库生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(二二)cDNA文文库的大小的大小一个一个cDNA文文库要包含要包含99%的的mRNA时所需要的克隆所需要的克隆数目数目。N=ln(1-p)ln(1-1n)p:文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）:某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因组基因组DNA文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因基因组DNA文文库的的优点点 相相对于于cDNA文文库，基因，基因组文文库的的优点：点：cDNA克隆只能反映着克隆只能反映着mRNA的分子的分子结构，没有包括基因构，没有包括基因组的的间隔序列；隔序列；cDNA文文库中，不同克隆的分布状中，不同克隆的分布状态总是反映着是反映着mRNA的的分布状分布状态，即：高丰度，即：高丰度mRNA的的cDNA克隆，所占比例克隆，所占比例较高，分高，分离基因容易；低丰度离基因容易；低丰度mRNA的的cDNA克隆，所占比例克隆，所占比例较低，分离低，分离基因困基因困难；从从cDNA克隆中，不能克隆到基因克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非中的非转录区段序区段序列，不能用于研究基因列，不能用于研究基因编码区外区外侧调控序列的控序列的结构与功能。构与功能。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA文文库的的优点点 cDNA文文库以以mRNA为材料，特材料，特别适用于某些适用于某些RNA病病毒等的基因毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。构研究及有关基因的克隆分离。cDNA文文库的的筛选比比较简单易行。易行。每一个每一个cDNA文文库都含有一种都含有一种mRNA序列，序列，这样在目在目的基因的的基因的选择中出中出现假阳性的概率就会比假阳性的概率就会比较低，因此阳性低，因此阳性杂交信号一般都是有意交信号一般都是有意义的，由此的，由此选择出来的阳性克隆将出来的阳性克隆将会含有目的基因。会含有目的基因。cDNA文文库可用于在可用于在细菌中能菌中能进行表达的基因的克隆，行表达的基因的克隆，直接直接应用于基因工程操作。用于基因工程操作。cDNA克隆克隆还可用于真核可用于真核细胞胞mRNA的的结构和功能构和功能生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA克隆的主要的缺点克隆的主要的缺点 cDNA文文库所包含的所包含的遗传信息要信息要远远少于基因少于基因组DNA文文库，并且受，并且受细胞来源或胞来源或发育育时期的影响。期的影响。cDNA文文库虽能反映能反映mRNA的分子的分子结构和功能信息，构和功能信息，但不能直接但不能直接获得基因内含子序列和基因得基因内含子序列和基因编码区外大量区外大量调控控序列的序列的结构与功能方面信息。构与功能方面信息。在在cDNA文文库中，相中，相应于高丰度于高丰度mRNA的的cDNA克隆所克隆所占的比例比占的比例比较高，分离起来比高，分离起来比较容易，而相容易，而相应于低丰度于低丰度mRNA的的cDNA克隆所占的比例克隆所占的比例则比比较低，因此分离也就低，因此分离也就比比较困困难。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得基因工程或基因工程或DNADNA重重组技技术三大用途的前提条件是从生物体基因三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达得之后，或确定其表达调控机制控机制和生物学功能，或建立高效表达系和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有，构建具有经济价价值的基因工程的基因工程菌（菌（细胞），或将目的基因在体外胞），或将目的基因在体外进行必要的行必要的结构功能修构功能修饰，然后，然后输回回细胞内改良生物体的胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治性状，包括人体基因治疗。一般来一般来说，目的基因的克隆，目的基因的克隆战略分略分为两大两大类：一：一类是构建感是构建感兴趣趣的生物个体的基因文的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建分段克隆，然后建立合适的立合适的筛选模型从基因模型从基因组文文库中挑出含有目的基因的重中挑出含有目的基因的重组克隆；另克隆；另一一类是利用是利用PCRPCR扩增技增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。后将之克隆表达。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得目的基因用途很广，主要有以下几个方面：目的基因用途很广，主要有以下几个方面：研究研究该基因的全貌与内涵，如基因的全貌与内涵，如详细分析其分析其结构、功能及构、功能及调控。控。与正常基因与正常基因对比，比，寻找异常基因的异常点，找异常基因的异常点，进而探索疾而探索疾病病发生的分子生物学机理及治生的分子生物学机理及治疗对策。策。研究生物种系研究生物种系进化与相关同源性。化与相关同源性。应用某种基因大量表达，生用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白所需要的蛋白质或多或多肽（如胰（如胰岛素、干素、干扰素等素等药物）。物）。在在农、林、牧、副、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改中，改造某些目的基因，以改良品种，促良品种，促进经济发展。展。建立基因建立基因疗法院，法院，选用某种正常基因用某种正常基因,引入患者体内，引入患者体内，对某些先天性某些先天性遗传疾病疾病进行治行治疗。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得基因工程的目的基因工程的目的采用采用DNA重重组技技术从不同生物基因从不同生物基因组中中优良性状相关良性状相关的基因克隆，的基因克隆，转移同一生物基因移同一生物基因组中，培育出具有高度中，培育出具有高度应用价用价值的新物种。的新物种。目的基因目的基因那些已被或者准那些已被或者准备要分离、改造、要分离、改造、扩增或表达的特定增或表达的特定基因或基因或DNADNA片段，主要指片段，主要指结构基因。构基因。目的基因包括目的基因包括蛋白（蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、生物）基因、抗逆性相关基因、生物药和保健品和保健品相关基因、毒物相关基因、毒物讲解相关的基因等。解相关的基因等。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成1.原核生物的基因原核生物的基因组成成（1）基因区：操）基因区：操纵子形式存在，但各基因分子形式存在，但各基因分别有有 ATG的起始密的起始密码子和子和TAA（TAG、TGA）的）的终止密止密码子。子。（2）启）启动区：区：RNApol识别、结合和开始合和开始转录的一段的一段DNA核苷酸序列。核苷酸序列。55TTGACATTGACATATAATTATAATA/GA/G3333AACTGTAACTGTATATTAATATTAT/CT/C55-35-35序列序列-10-10序列序列识别序列识别序列PribnowPribnow框框转录起点转录起点161619bp19bp5 59bp9bp生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成1.原核生物的基因原核生物的基因组成成（3）SD区：在起始密区：在起始密码子子ATG上游上游约10bp处，有一个，有一个富含富含嘌呤的保守序列，其与呤的保守序列，其与16S rRNA3端序列互端序列互补。SD序列与起始密序列与起始密码子子ATG之之间的距离决定了的距离决定了mRNA在在细菌中的菌中的转录效率。效率。SDSD序列：序列：5AGGAGGU35AGGAGGU33UCCUCCA3UCCUCCA5 5 16S rRNA16S rRNA生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成1.原核生物的基因原核生物的基因组成成（4）转录终止子和止子和终止因子止因子转录终止子：一个基因或一个操止子：一个基因或一个操纵子子3端，提供端，提供转录停止信号的停止信号的DNA核苷酸序列。核苷酸序列。终止因子：止因子：协助助RNA聚合聚合酶识别终止信号的止信号的辅助因子助因子的蛋白。的蛋白。-independent生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得Rho protein dependent terminationRho protein dependent termination生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成2.真核生物基因真核生物基因组成成（1）基因区）基因区生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子(一一)结构基因组成结构基因组成2.真核生物基因组成真核生物基因组成（1）基因区）基因区生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成2.真核生物基因真核生物基因组成成（2转录启启动区区mRNArDNAmDNAtDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa35构成核糖体NmRNAproteinP1P3P2P1、P2和和P3个有不同的结构特点。个有不同的结构特点。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成2.真核生物基因真核生物基因组成成（2）转录启启动区区-25的的TATA box：起始双起始双链解开，并决定解开，并决定转录的起始位点；的起始位点；-80的的CAAT box：可能与可能与RNApol结合有关；合有关；-100的的GCbox：转录因子（如因子（如spI因子）的因子）的结合序列。合序列。CAAT box和和GC box对转录起始效率起始效率较大的影响。大的影响。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因构基因组成成2.真核生物基因真核生物基因组成成（3）转录终止子：止子：对真核生物真核生物转录的的终止子信号和止子信号和终止止过程了解甚少。程了解甚少。但在高等真核生物的但在高等真核生物的细胞中，胞中，mRNA在靠近在靠近3端区有一段端区有一段非常非常conservative sequence AAUAAA，这一序列一序列为链的切断和的切断和pol(A)化提供了某些化提供了某些终止信号。止信号。不含不含SDSD序列，核糖体与序列，核糖体与mRNA 5mRNA 5端的帽子结构结合端的帽子结构结合生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(二二)其他基因其他基因组基因的基因的组成成1.质粒的基因粒的基因少量少量结构基因、基因构基因、基因组成成简单，启，启动子、子、编码区和区和终止子，无内含子。止子，无内含子。2.病毒的基因病毒的基因多多顺反子、重叠基因、有的基因含有内含子。反子、重叠基因、有的基因含有内含子。3.线粒体的基因粒体的基因能源代能源代谢相关的基因、多相关的基因、多顺反子、反子、动物物Mt基因没有内基因没有内含子，而植物含子，而植物Mt基因含有内含子，有的没有。基因含有内含子，有的没有。4.叶叶绿体的基因体的基因光合作用相关的基因，多光合作用相关的基因，多顺反子形式反子形式进行行转录，具，具有原核生物相似的启有原核生物相似的启动子。子。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得色氨酸的合成分色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。磷酶合成酶。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(三三)基因的排列基因的排列基因基因组的每个基因一般一个一个直的每个基因一般一个一个直线排列在排列在DNA分子分子上，并且两个基因之上，并且两个基因之间存在非存在非编码的的间隔序列，但存在一隔序列，但存在一些特殊排列。些特殊排列。1.重叠基因重叠基因(overlapping genes)-ATG-TCATGCCCAA-ATGAGGC-Vp2 StartVp1 StartVp3 Start核苷酸序列彼此重叠的基因核苷酸序列彼此重叠的基因，即不同基因共用同一段，即不同基因共用同一段DNA的核苷酸序列，他们的核苷酸序列彼此重叠。的核苷酸序列，他们的核苷酸序列彼此重叠。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(三三)基因的排列基因的排列2.重复基因（重复基因（repeated gene or duplicated gene）原核生物基因原核生物基因组 单拷拷贝基因基因 真核生物基因真核生物基因组 约30%的基因是多拷的基因是多拷贝例如：免疫球蛋白基因、例如：免疫球蛋白基因、组蛋白基因蛋白基因2006年年3月月15日日报道：道：随着多种生物基因随着多种生物基因组被破被破译，科学家，科学家证明生物的新基明生物的新基因是通因是通过基因重复基因重复获得的。美中两国科学家得的。美中两国科学家组成的研究小成的研究小组在最近的研究中在最近的研究中证明，明，进化理化理论所推断的所推断的“重复基因中重复基因中的一部分可能的一部分可能产生新功能，有助于生物生新功能，有助于生物对环境适境适应”的的论断是正确的。断是正确的。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(三三)基因的排列基因的排列3.加倍基因加倍基因多倍体生物中的基因，多倍体生物中的基因，与重复基因相似与重复基因相似高等生物：高等生物：2n=两套基因两套基因组原核生物：原核生物：n=一套基因一套基因组蓝 藻：藻：多倍性染色体，存在多套基因，不易多倍性染色体，存在多套基因，不易获得基因突得基因突变体体生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(三三)基因的排列基因的排列4.基基 因因 重重 排排有的基因有的基因组中，同一基因簇中，同一基因簇处在不同在不同细胞中胞中时，基因，基因排列会排列会发生生变化。化。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得目的基因分离目的基因分离目的基因分离目的基因分离是基因工程研究和是基因工程研究和是基因工程研究和是基因工程研究和应应用的关用的关用的关用的关键键内容内容内容内容不同基因不同基因不同基因不同基因组类组类型的型的型的型的基因基因基因基因组组大小大小大小大小、基因基因基因基因组组成成成成和和和和基因排列基因排列基因排列基因排列各不相同各不相同各不相同各不相同 根据不同的根据不同的根据不同的根据不同的实验实验要求，采用不同的途径和方法分离目的要求，采用不同的途径和方法分离目的要求，采用不同的途径和方法分离目的要求，采用不同的途径和方法分离目的基因基因基因基因分离的基因分离的基因promoter or terminatorpromoter or terminator编码区：只分离编码区：只分离ORFORF操纵子：启动子、功能相关的编码基因和终止子操纵子：启动子、功能相关的编码基因和终止子有功能的基因：启动区、编码区和终止区有功能的基因：启动区、编码区和终止