液相串联质谱法在生物样品分析中的几个关键问题省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

in20%40%60%80%100%Intensity,cps吉林大学药品代谢研究中心第3页10月10日血浆样品经液液萃取处理得到谱图血浆样品经液液萃取处理得到谱图 Intensity,cps1.02.03.04.05.06.07.0Time,min20%40%60%80%100%吉林大学药品代谢研究中心第4页10月10日Intensity,cps1.02.03.04.05.06.07.0Time,min20%40%60%80%100%血浆样品经血浆样品经SPE处理得到谱图处理得到谱图 吉林大学药品代谢研究中心第5页10月10日尿样经液液萃取处理得到谱图尿样经液液萃取处理得到谱图 Intensity,cps1.02.03.04.05.06.07.0Time,min20%40%60%80%100%吉林大学药品代谢研究中心第6页10月10日Intensity,cps1.02.03.04.05.06.07.0Time,min20%40%60%80%100%尿样经尿样经2次水洗后液液萃取处理得到谱图次水洗后液液萃取处理得到谱图 吉林大学药品代谢研究中心第7页10月10日吉林大学药品代谢研究中心考查基质效应方法考查基质效应方法柱后赔偿技术（柱后赔偿技术（Post-column Post-column addition/infusion,PCA/PCIaddition/infusion,PCA/PCI）赔偿标准品溶液，以空白基质提赔偿标准品溶液，以空白基质提取物进样测定取物进样测定-位置、强度位置、强度标准溶液进样；标准溶液进样；等量标准溶液加等量标准溶液加入空白基质提取物中进样；二者峰面入空白基质提取物中进样；二者峰面积比较积比较 液相系统液相系统 色谱柱色谱柱 质谱质谱 三通阀三通阀 注射泵注射泵 第8页10月10日基质效应产生原因外源杂质引入外源杂质引入（不一样厂家（不一样厂家生产试管、肝生产试管、肝素锂）素锂）生物样品内源性生物样品内源性基质共洗脱作用基质共洗脱作用co-elutionco-elution生物样品与分析生物样品与分析物形成新化合物物形成新化合物柱超载作用柱超载作用(column(column overload)overload)吉林大学药品代谢研究中心第9页10月10日吉林大学药品代谢研究中心影响检测灵敏度1影响定量准确性2基质效应结果第10页10月10日Key Point 2选择适当内标提升待测物离子化效率、降低基质效应Key Point 1关键问题提升LC/MS/MS工作效率Key Point 3吉林大学药品代谢研究中心第11页10月10日提升离子化效率 1、改进雾化效果 产生更多更小液滴，提升离子/分子转化比。2、模式选择及优化办法 酸性化合物流动相中加盐,如甲酸铵、乙酸铵，或碱（氨水）来增强化合物离子化，普通采取负离子检测模式。碱性化合物流动相中加酸以增强化合物离子化,加甲酸效果可能要好于醋酸和三氟乙酸。酸根负离子会与样品正离子结合降低离子化效率，且三氟乙酸会显著抑制质谱信号响应，普通用正离子方式检测。3、慎重选择添加剂 商品化LC-MS级醋酸铵、甲酸铵含有表面活性剂，抑制电离。试验中若需要，能够用氨水加酸调整而成。吉林大学药品代谢研究中心第12页10月10日 4、优化仪器参数（DP、CE、IS等）5、盐类对离子信号影响 普通小分子盐摩尔浓度比较高时，在电喷雾系统中有强烈竞争性离子化作用，造成较强离子抑制效应，使得待测物灵敏度显著降低。其次，盐类存在将产生一系列离子加合峰，使得谱图解析变复杂。另外，太多盐类会腐蚀和污染质谱系统硬件，严重时造成硬件损坏，需要及时清洗。高浓度盐对电喷雾有显著负作用，微量盐可能有利于一些物质灵敏度提升。一些不挥发盐，如磷酸盐、氯化钠等，对质谱造成不可逆损伤。高盐类样品，进样前普通要进行脱盐处理。6、控制进样浓度及上样量 色谱柱、质谱超载 吉林大学药品代谢研究中心进样浓度大上样量大第13页10月10日吉林大学药品代谢研究中心Mass Spectrometry Reviews,20,362 387第14页10月10日消除/减小基质路径吉林大学药品代谢研究中心样品处理液相条件选择质谱条件选择第15页10月10日Protein-precipitationProtein-precipitationLiquid-liquid partitioning(extraction)Liquid-liquid partitioning(extraction)Solid Phase extractionSolid Phase extractionOff-line/On-line 2-Dimension LC(column Off-line/On-line 2-Dimension LC(column back-flushing)back-flushing)吉林大学药品代谢研究中心样品前处理方法样品前处理方法 选择适当样品前处理方法是消除基质效应影响最有效方式，对于不一样样品处理方法，基质对每种组分影响也不一样，要经过试验综合其它参数（提取回收率，提取稳定性，定量限等）来确定样品前处理方法。第16页10月10日柱子选择 填料性质、大小、柱长、柱子口径流动相选择 组成、百分比、流速、缓冲盐、信号增强剂、pH值；洗脱方式选择（等梯度、梯度）；柱后赔偿 碱性药品丙酸、异丙醇；酸性药品2-（2-methoxyethoxy)ethanol。吉林大学药品代谢研究中心优化液相色谱条件优化液相色谱条件 适当地增加待测组分保留时间；降低进样体积第17页10月10日离子源（ESI、APCI）选择：总趋势 ESI较APCI更易受基质效应影响。检测方式（负离子、正离子扫描方式）吉林大学药品代谢研究中心优化质谱检测条件优化质谱检测条件第18页10月10日吉林大学药品代谢研究中心双内标法提升双内标法提升LC/MS/MS分析准确性分析准确性第19页10月10日吉林大学药品代谢研究中心提升提升LC/MS/MSLC/MS/MS工作效率工作效率Standard programNew program第20页10月10日吉林大学药品代谢研究中心第21页10月10日吉林大学药品代谢研究中心第22页10月10日谢谢第23页