生物化学方法省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

一、研究背景l二、研究目和意义l三、研究内容l四、技术路线l五、提取流程l六、可行性分析l七、实验结果l八、社会效益及应用前景l九、经费预算第2页 人们大都把注意力集中在提升作物坚固器官蛋白质含量上，较少关注植物叶蛋白开发利用，烟叶蛋白除了含有蛋白质基本功效特征外，还含有许多特殊功效特征。烟叶蛋白中富含硒，以硒蛋氨酸和硒半胱氨酸或其它形式存在。硒含有广泛医疗保健作用，补充硒能预防癌症、肝炎、心血管疾病等，硒对癌症病人化疗有预防白细胞降低作用。然而，硒又是营养剂量与毒性剂量范围很窄微量元素，所以，发展含有低毒高效属性硒产品，用于预防与治疗相关疾病意义重大。利用烟叶对无机硒代谢，可得到蛋白质态硒；无机硒在转化为蛋白质态硒过程中，毒性大大降低，主要表现为急性毒性大幅下降。烟草中蛋白质分为可溶性蛋白和不溶性蛋白。12左右可溶性蛋白是叶绿体蛋白(Fraction I protein，F I蛋白)。另外12为其它可溶性蛋白质复合物(Fraction 1Iprotein，F蛋白)一、研究背景一、研究背景第3页二二 研究目和意义研究目和意义 烟草蛋白是一个极具利用潜力和发展前景植物蛋白资源，深入研究开发这种资源对于提升烟草综合利用价值，稳定烟草种植和增加烟农收入，促进我国烟草行业可连续发展和产业结构调整均含有主要意义。第4页二二 研究目和意义研究目和意义 l 特异特异第5页三三、研究内容、研究内容1蛋白质纯度分析与判定蛋白质纯度分析与判定2检测硒蛋白质对癌症影响检测硒蛋白质对癌症影响3从烟草中提取硒蛋白第6页四、技术路线四、技术路线第7页l1.1.生物材料选择生物材料选择l2.2.细胞破碎：借助超声波振动力细胞破碎：借助超声波振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎细胞壁和细胞器。l3.3.生物大分子提取生物大分子提取 ：磷酸缓冲：磷酸缓冲液对蛋白质稳定性好液对蛋白质稳定性好 l4.生物大分子纯化：亲和层析生物大分子纯化：亲和层析 第8页五、提取流程五、提取流程 纯度分析：标准曲线制备图1 牛血清白蛋白（BSA）考马斯亮蓝染色标准曲线提取率(%)=提取蛋白质质量花生质量 100%第9页五、提取流程五、提取流程 烟草蛋白提取方法：烟叶烟叶捣碎捣碎加水加水磨浆磨浆碱溶（用碱溶（用KOHKOH溶液提取）溶液提取）（200200目滤布）过滤目滤布）过滤滤渣滤渣再碱溶两次再碱溶两次滤液离心（滤液离心（4800rpm4800rpm，2020，30min30min）除杂）除杂上清液酸沉上清液酸沉离心离心（4800rpm4800rpm，44，30min30min）沉淀蛋白）沉淀蛋白富硒花生含硒蛋白样品制备脱脂富硒花富硒花生含硒蛋白样品制备脱脂富硒花生粉生粉加碱液搅拌加碱液搅拌离心分离离心分离得上清液得上清液调整调整pH pH 至等电点至等电点离心分离离心分离透析透析24h24h干燥得蛋白样品干燥得蛋白样品a.a.水溶性含硒蛋白提取水溶性含硒蛋白提取:准确称取准确称取5g 5g 蛋白样品于蛋白样品于100mL 100mL 蒸馏水中，蒸馏水中，60 60搅拌搅拌20min20min，4000r/min 4000r/min 离心离心20min20min，用少许蒸馏水洗涤残渣，离心合并上清液。，用少许蒸馏水洗涤残渣，离心合并上清液。透析透析24h24h，冷冻干燥得蛋白样品。，冷冻干燥得蛋白样品。b.b.醇溶性含硒蛋白提取醇溶性含硒蛋白提取:取所得残渣取所得残渣1g1g，加入，加入100mL 75%100mL 75%乙醇，提取方法同乙醇，提取方法同a a。c.c.盐溶性含硒蛋白提取盐溶性含硒蛋白提取:取所得残渣取所得残渣1g1g，加入，加入100mL 0.5mol/L NaCl 100mL 0.5mol/L NaCl 溶液，提溶液，提取方法同取方法同a a。d.d.碱溶性含硒蛋白提取碱溶性含硒蛋白提取:取所得残渣取所得残渣1g1g，加入，加入100mL 0.1mol/L NaOH 100mL 0.1mol/L NaOH 溶液，提溶液，提取方法同取方法同a a。1.2.2 1.2.2 矿物质元素分析富硒花生和普通花生经过粉碎、石油醚脱脂、干燥制备成矿物质元素分析富硒花生和普通花生经过粉碎、石油醚脱脂、干燥制备成细粉，在电炉上用混合酸细粉，在电炉上用混合酸(HNO3 HClO4=41)(HNO3 HClO4=41)消化后使用火焰原子吸消化后使用火焰原子吸收光谱法对钙、镁、锌、硒含量进行测定，三次重复收光谱法对钙、镁、锌、硒含量进行测定，三次重复第10页五、可行性分析五、可行性分析课题组组员均进行过试验培训研究，具备课题组组员均进行过试验培训研究，具备相关试验技术和方法相关试验技术和方法新疆大学生物资源基因工程重点试验新疆大学生物资源基因工程重点试验室设备齐全：电泳设备，室设备齐全：电泳设备，PCR仪，高仪，高速冷冻离心机，全自动高压灭菌锅，速冷冻离心机，全自动高压灭菌锅，振荡培养箱，蒸馏水器，超净工作台，振荡培养箱，蒸馏水器，超净工作台，酶标仪等酶标仪等材料不受季节本课题思绪明确，技术路材料不受季节本课题思绪明确，技术路线可行线可行可行性分析可行性分析第11页六、预六、预 期期 成成 果果1 12 23 34 45 5NbL42纳米抗体构建NbL42纳米抗体克隆表示NbL42纳米抗体分离及纯化NbL42纳米抗体蛋白定量测定6 6整理并发表论文1-2篇使得NbL42抗体框架作为小分子抗体通用移植骨架成 为可能，为研发新抗体提供基础。第12页七、社会效益及应用前景七、社会效益及应用前景v烟草烟草是分子遗传学中研究最多植物材料，用烟草花叶病病毒将新基因导入烟草植株，使新基因得到表示，在收获烟叶里含有这种新基因蛋白质，用这种方法已经得到人血红蛋白成份因为绝大部分蛋白基因都能被导入烟草花叶病毒中，也就是说能够从烟草中得到任何一个遗传工程蛋白。未来烟草还能够生产出抗癌抗艾滋病等大量有用物质。v未来不但会培育出高香气、低蛋白、低危害烟草用于卷烟，而且还会培育出食用和药用高蛋白烟草造福人类。第13页八、经费预算八、经费预算科 目申请经费备注(计算依据与说明)1科研业务费45500(1)试验室管理和仪器使用费30000超声波、离心机等仪器(2)能源/动力费15000(3)出版物/文件/信息传输费500资料复印费用2试验材料费26000(1)原材料/试剂/药品购置费0各种酶、抗体、化学试剂和试剂盒(2)其它60003试制仪器设备费25004.劳务费6000硕士2人，250元/月，12个月共6000累计80000 第14页第15页蛋白质提取柱层析结晶法、双水相萃取法蛋白质纯化及纯度分析考马斯亮蓝、第16页v双水相萃取法Balasubramaniam等啪1研究了烟草蛋白在双水相系统中分配系数改变。经过改变PEG(聚乙二醇)分子量、PEG浓度、无机盐种类和浓度、pH值等条件来得到烟草蛋白在2相中最正确分配系数，从而确定最正确双水相萃取条件。伴随转基因技术在烟草中成功应用，烟草通惯用来生产各种转基因蛋白。这些微量蛋白分离，通常采取双水相萃取法来实现。柱层析结晶法Lowe等o摒弃了传统超滤和透析脱盐处理，采取Sephadex G-50交联葡聚糖凝胶柱对烟草蛋白提取液进行脱盐除杂处理，结晶蛋白得率比传统方法高。不过，Lowe方法在烟草蛋白提取过程中，必须将大量新鲜烟叶投入到少许浓氯化钠溶液(5 molL)中进行匀浆，操作比较困难，轻易损坏捣碎机。另外，提取液需要经过l根粗大葡聚糖凝胶柱。这些均限制了烟草蛋白结晶制备规模。第17页