南农生物分离工程生物分离7亲和省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

亲和层析亲和层析第1页生物亲和作用n生物亲和作用本质n影响亲和作用原因n亲和作用体系第2页 生物亲和作用本质n生物分子间特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。n利用生物分子间这种特异性结合作用原理进行生物物质分离纯化技术称为亲和纯化（affinity purification）。n亲和作用分子（物质）对能够是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。第3页 第4页 配基固定化、吸附样品、样品解吸配基固定化、吸附样品、样品解吸“亲和吸附剂亲和吸附剂”：载体与固定化配基总称：载体与固定化配基总称第5页n含有亲和作用分子对之间含有“钥匙”和“锁孔”空间结构关系。n亲和结合作用，最少存在3个对应官能团相结合：n静电作用 n氢键 n疏水相互作用n配位键 n弱共价键 图5-1 蛋白质结合部位及各种结合作用力第6页 亲和作用体系 n将亲和体系中一个分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一个分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。n普通将被固定分子称为其亲和结合对象配基（ligand），用L表示。nKeq越大，亲和结合作用越强。Keq普通为104108 L/mol，最高可到达1015 L/mol。第7页惯用亲和作用体系惯用亲和作用体系特异性特异性 亲和作用体系亲和作用体系高特异性高特异性 抗原抗原-单克隆抗体单克隆抗体 荷尔蒙荷尔蒙-受体蛋白受体蛋白 核酸核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶酶-底物、产物、抑制剂底物、产物、抑制剂群特异性群特异性 免疫球蛋白免疫球蛋白-A蛋白、蛋白、G蛋白蛋白 酶酶-辅酶辅酶 凝集素凝集素-糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质酶、蛋白质-肝素肝素 酶、蛋白质酶、蛋白质-活性色素（染料）活性色素（染料）酶、蛋白质酶、蛋白质-过分金属离子过分金属离子 酶、蛋白质酶、蛋白质-氨基酸（组氨酸等）氨基酸（组氨酸等）第8页 亲和色谱 n亲和色谱特点 选择性高、特异性极强,以胰岛素提取胰岛素受体，一步纯化8000倍 分离精度高：可用于分离含量极低，结构相分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近化合物近化合物n亲和色谱不足通用性差，洗脱条件苛刻费用高第9页 亲和色谱填料n亲和吸附作用是在特定配基存在下实现，需依据目标产物选择适当亲和配基修饰固定相粒子，制备所需亲和吸附介质。n少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一个植物凝集素）。n在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物需要，有必要自制亲和吸附介质。第10页 亲和配基亲和配基n配基选择配基选择 足够大亲和力足够大亲和力 结合专一结合专一 牛胰蛋白酶抑制剂牛胰蛋白酶抑制剂:除与牛胰蛋白酶除与牛胰蛋白酶,还与胰凝还与胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用乳蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用 配基有化学活性配基有化学活性 第11页n配基浓度配基浓度 亲和势较低（亲和势较低（KL 10-4mol/L），增加配基浓度），增加配基浓度或增加柱长或增加柱长 大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖，大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖，吸附强，非专一性吸附吸附强，非专一性吸附 理想配基浓度理想配基浓度1-10mol/L，2 mol/L凝胶凝胶 n配基分子大小配基分子大小 首选大分子或插入首选大分子或插入“手臂手臂”第12页n偶联位置偶联位置 e结合有效，结合有效，偶联位置造成偶联位置造成 亲和力差异，可吸附不一样配体亲和力差异，可吸附不一样配体 第13页n亲和配基1.酶抑制剂 n小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。底物底物，亲和力抑制剂，专一性较差，亲和力抑制剂，专一性较差，转变为产物，用不适转变为产物，用不适pH，缺乏辅因子，缺乏辅因子 辅酶辅酶：专一性不强：专一性不强 第14页2.抗体n利用抗体为配基亲和色谱又称免疫亲和利用抗体为配基亲和色谱又称免疫亲和色谱（色谱（immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间）。抗体与抗原之间Keq普通为普通为1071012 L/mol。n利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子有效伎俩。类生物大分子有效伎俩。第15页3.A蛋白nprotein A为分子量约42 kD蛋白质，与IgG含有很强亲和作用，结合部位为IgG分子Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。n不一样IgGFc片段结构非常相同，所以A蛋白可作为各种抗体亲和配基，但不一样抗体结合常数有所不一样。nA蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原结合能力，所以A蛋白也可用于分离抗原-抗体免疫复合体。第16页4.凝集素n凝集素（lectin）是与糖特异性结合蛋白质（酶和抗体除外）总称。n伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A）可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子分析、纯化。npH5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH5.6时为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间经过二硫键结合。n在利用con A为配基亲和色谱操作中，操作条件应该适宜。第17页5.辅酶和磷酸腺苷n脱氢酶和激酶与辅酶之间含有亲和结合作用。辅 酶 主 要 有 NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶亲和配基。nAMP（adenosine 5-monophosphate）、ADP（adenosine 2，5-diphosphate）腺苷部分与上述辅酶结构类似，可用做这些酶亲和配基。第18页6.三嗪类色素n利用色素为配基亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligand affinity chromatography）。nTriazine dyes是一类分子内含有三嗪环合成染料，与NAD结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶 等含有很高亲和力。nCibacron Blue F3GA：第19页7.过渡金属离子nCu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可经过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质配基。n这种利用金属离子为配基亲和色谱普通称为金属螯合色谱（metal chelate chromatography）或固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）。第20页8.组氨酸 n组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用都有可能参加亲和结合。n在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI溶液中，固定化组氨酸亲和吸附作用最强，伴随盐浓度增大，亲和吸附作用降低。第21页9.肝素n肝素（heparin）是存在于哺乳动物肝、肺、肠等脏器中酸性多糖类物质，分子量普通为5至30 kD，含有抗凝血作用。n肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等含有亲和作用，可用作这些物质亲和配基。n肝素亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，伴随盐浓度增大结合作用降低。第22页n亲和色谱填料载体n亲和色谱理想载体应含有以下特征：不溶性；渗透性；高硬度及适当颗粒形式；最低吸附力；很好化学稳定性；抗微生物和酶侵蚀；亲水性；含有大量供反应化学基团。第23页n常规亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料。n近年来，为了满足快速高效分离需要，以多孔硅胶和合成高分子化合物为载体高效AFC色谱填料，得以快速发展。n亲和色谱填料制备过程普通包含：载体（carrier、support）选择、载体活化和配基连接。第24页亲和吸附载体种类亲和吸附载体种类种类组成性能多孔玻璃载体硅酸盐坚硬、耐酸碱、易修饰聚丙烯酰胺凝胶载体丙烯酰胺N,N-亚甲基双丙烯酰胺亲水性好可供活化基团多纤维素载体多糖类物质起源丰富，但非特异性吸附及空间位阻强，对分离不利葡聚糖凝胶载体经环氧氯丙烷交联多糖类理化性质稳定，但粒径太小第25页惯用载体惯用载体 1.纤维素纤维素 活化后带电荷，非特异性吸附强，结构紧密，活化后带电荷，非特异性吸附强，结构紧密，小分子配基亲和位阻大小分子配基亲和位阻大,分离与核酸相关物质（分离与核酸相关物质（oligo)dT-mRNA 2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 Sepharose 4B最正确，活性基团多，孔径大，最正确，活性基团多，孔径大，几乎无带电基团，交联后稳定性几乎无带电基团，交联后稳定性 第26页 3.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 孔径小，孔径小，G-200经过经过105级，配基偶联后，级，配基偶联后，膨胀度膨胀度，表面亲和病毒、细胞，表面亲和病毒、细胞 4.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 较多酰胺基，配基偶联后网格缩小较多酰胺基，配基偶联后网格缩小 pH2-11，理化稳定，防止接触强氧化剂，理化稳定，防止接触强氧化剂 5.多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass)理化稳定，亲水性不强，非特异性吸附，理化稳定，亲水性不强，非特异性吸附，化学活性基团少化学活性基团少 克服：商品连接氨烷基，葡聚糖包被克服：商品连接氨烷基，葡聚糖包被第27页n部分商品化色谱填料表5-2 部分商品化色谱填料第28页 影响亲和力原因影响亲和力原因n配基浓度配基浓度（解离常数解离常数）配基浓度高有利配基浓度高有利,低亲和力系统：配基浓度低亲和力系统：配基浓度配体浓度配体浓度 高亲和力系统高亲和力系统:配基浓度大不利配基浓度大不利第29页空间障碍n对于亲和力低，分子量特大亲和对，小对于亲和力低，分子量特大亲和对，小分子配基，分子配基，加手臂加手臂 活化方法引入活性基团，起到间隔臂作用活化方法引入活性基团，起到间隔臂作用 C C6 6烃链，烃链，C C8 8亲和力下降亲和力下降第30页n配基与载体结合位点配基与载体结合位点 多肽、蛋白作配基，以多肽、蛋白作配基，以最少键最少键与载体连接与载体连接 以以-NH2表面，较低表面，较低pH降低连接点，降低连接点，PH9.5位点多位点多 胰岛素：胰岛素：pH9.5，2个个-NH2连，亲和力连，亲和力1/10 pH6.5，1个个-NH2连，连，第31页n载体孔径载体孔径 排阻限最少大于配体分子量排阻限最少大于配体分子量1个数量级个数量级 配基和大分子（抗原抗体）亲和力高或配体很大配基和大分子（抗原抗体）亲和力高或配体很大 （细胞器、完整细胞），多孔不主要，在表面（细胞器、完整细胞），多孔不主要，在表面 配体配体Bio-gel P300(300000)Sepharose 4B(2107)核酸酶（核酸酶（7000）+-半乳糖苷酶（00）-+第32页微环境微环境 化学作用：载体及手臂电性极性，防止引入含化学作用：载体及手臂电性极性，防止引入含离子键基团，配基与载体手臂氢键离子键基团，配基与载体手臂氢键第33页载体活化和偶联载体活化和偶联n亲和吸附载体通常是惰性，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化，活化方法主要有：n溴化氰活化法溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐；n高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺n环氧化法环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联；n甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法：n双功效试剂法 二乙烯砜第34页第35页n载体活化和配基连接1.溴化腈活化法n用于多糖凝胶活化，固定活性基团为氨基配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载体活化在碱性（pH10）条件下数分钟即可完成，之后配基修饰亦需在碱性条件进行，普通使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：第36页n活化步骤活化步骤 琼脂糖与等量水混合，溴化氰充分粉碎，琼脂糖与等量水混合，溴化氰充分粉碎，湿胶湿胶CNBr=10-20 1，18-20，pH10.80.1，搅拌，搅拌，8-12分钟分钟第37页n洗涤洗涤 大量大量0.1M NaHCO3(pH8.5-9.5)洗涤、抽滤洗涤、抽滤 冷、快（冷、快（5-10分钟）分钟）n偶联偶联 非质子化氨基非质子化氨基NH2-P，环境，环境pH氨基氨基pK 4，4-24h(6h)，后用氨基化合物（乙醇胺），后用氨基化合物（乙醇胺）“中和中和”或或“封闭封闭”残余活化基团残余活化基团第38页2.环氧基活化法n可用于固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH配基。惯用活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水甘油醚（BGE）和环氧氯丙烷。第39页环氧化法环氧化法表氯醇第40页3.硅胶活化n活化硅胶常采取硅烷化试剂，如-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：n引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基可发生二醇化反应：第41页4.间隔臂n当配基较小时，将其直接固定在载体上，会因为载体空间位阻，配基大分子不能发生有效亲和吸附作用。这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂（spacer）”，使其发生有效亲 和结合。图5-2 间隔臂作用第42页n在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中双环氧化合物起间隔臂作用。n实际上，除CNBr活化法外，其它活化法都引入了不一样活性基因，这些活性基团假如有适当长度，都可起到间隔臂作用。n利用CNBr活化法固定小分子配基时，普通需先引入-氨基已酸或1,6-二氨基已烷后再用对应方法固定配基。n引入间隔臂长度是有一定限制，当间隔臂超出一定长度时，配基与目标分子亲和力又会减弱。第43页配基偶联方法配基偶联方法n载体经活化后，就能够进行与配基偶联反应。详细方法以下：n碳二亚胺缩正当n酸酐法n叠氮化法n重氮化法第44页 吸附和洗脱一、影响吸附条件n平衡缓冲液 平衡固定相，保持pH，I 平衡流动相，靠近生理条件 洗涤，洗脱 近中性pH、低I或添加辅因子n吸附温度 10n样品 1.吸附容量 图 原因：吸附剂、条件 吸附容量普通小于配基浓度1/100 前沿分析法第45页 2.样品浓度 亲和力大，浓度不主要，太浓影响扩散，专一性下降 亲和力小，浓度亲和效果峰集中 普通蛋白3%n吸附平衡流速 大分子配体与配基吸附平衡需较长时间 高温数小时，低温数天 操作：先平衡、低流速10ml/ch 亲和力大，流速快，抗原抗体 亲和力小，流速慢，抑制剂、底物类似物与酶 非特异性吸附：离子效应、疏水基团第46页二、清洗n清洗：与吸附操作相同缓冲液，确定时间 第47页n非特异性洗脱法n非特异性洗脱经过调整洗脱液pH值、离子强度（NaCl%)、离子种类或温度等理化性质降低目标产物亲和吸附作用，是使用较多洗脱方法。纯化几个酶 抗原抗体降低缓冲液极性（加乙二醇）加蛋白变性剂，洗脱后稀释透析n 亲和色谱洗脱方法亲和色谱洗脱方法第48页 n特异性洗脱法n利用含有与亲和配基或目标产物含有亲和结合作用小分子化合物溶液为洗脱剂，经过与亲和配基或目标产物竞争性结合，脱附目标产物。n比如：Lys和Arg均为t-PA抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。“正洗脱正洗脱”惯用游离配基抑制剂、辅酶、底物、结构类似物惯用游离配基抑制剂、辅酶、底物、结构类似物 第49页n利用con A为配基目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。n特异性洗脱法洗脱条件温和，有利于保护目标产物生物活性，另外，因为仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低亲和体系（比如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重物系，特异性洗脱法有利于提升目标产物纯度。第50页“负洗脱负洗脱”：酶必须先结合：酶必须先结合A才能结合才能结合B，普通选，普通选A 作配基，若选作配基，若选B作配基，流动相含作配基，流动相含A，洗脱时不含洗脱时不含A 如如NADH使乳酸脱氢酶吸附在固定化丙酮酸类似物上，使乳酸脱氢酶吸附在固定化丙酮酸类似物上，洗脱液中不含洗脱液中不含NADH，脱氢酶被洗脱，脱氢酶被洗脱第51页再生再生 通常无需再生 非特异性吸附因为变性蛋白沉积，用6mol/L脲 提纯t-PA、干扰素 干扰素：细胞诱导产生，杂蛋白多，(NH4)2SO4 沉淀，凝胶过滤，离交，电泳，产率10%亲和层析，一步提纯3600倍，活力回收率高 第52页 应用举例 1.t-PA纯化n组织纤溶酶原激活剂（t-PA）是一个糖蛋白，含有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解作用，是治疗血栓等心脑血管疾病蛋白药品。n赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与t-PA含有亲和结合作用，惯用做亲和色谱纯化t-PA配基。n图5-3是利用精氨酸-Sepharose 4B亲和色谱法纯化猪心组织t-PA结果。原料为猪心丙酮粉经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。第53页图5-3 精氨酸-Sepharose 4B亲和色谱第54页2.干扰素纯化n干扰素（interferon，IFN）对癌症、肝炎等疾病含有特殊疗效。nIFN主要分、和三种类型，可经过动物细胞培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产。n色素亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱和免疫亲和色谱可用于IFN纯化。n如图5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大肠杆菌重组人白细胞干扰素（rhIFN-）操作条件和结果。rhIFN-比活提升了1150倍，收率达95。第55页图5-4 单抗免疫亲和色谱法纯化rhIFN-第56页n1凝胶层析原理是什么？n2 亲和层析原理是什么？n3例举三种以上亲和作用分子对。第57页