HPLC校验方案.doc

西安益尔渭之阳制药有限公司
高效液相色谱仪校验报告
(Xi’an Yier Weizhiyang Pharmaceutical CO.,LTD HPLC Calibration Protocol)

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二零零五年三月

高效液相色谱仪校验报告
Detail HPLC Calibration protocol
1. 适用范围
该方案仅针对于本公司新购，使用中以及大修后的具有紫外-可见波长检测器的高效液相色谱仪(HPLC)的检定。
2. 检定结果处理和检定周期
按此要求检定合格的仪器为合格仪器，反之，为不合格。
仪器的检定周期为1年。
3. 校验依据
中华人民共和国国家计量检定规程 JJG 705-2002《液相色谱仪》
4. 液相色谱检定的主要技术指标
检定项目
标准
外观
参见校验报告
泵
流量设定误差
<±5%
流量稳定性误差
<±3%
梯度准确度误差
<3%
柱温箱
温度设定误差
<±2°C
控温稳定性误差
£1°C
检测器
基线漂移(AU/h)
£5X10-3
基线噪声(AU)
£5X10-4
最小检测浓度(g/ml)
£1X10-7
波长示值误差
£±2nm
波长示值重复性
£±2nm
线性范围
≥103
定性、定量重复性
定性测量重复性误差
£1.5%
定量测量重复性误差
£2.0%
手动进样器
相对准确度
£2.0%
5.校验内容
5-1 检定环境
要 求
结 果
温 度
15°C ~30°C

相对湿度
20%~ 85%

5-2 受检仪器组成
液相色谱
型号

制造商

手动进样器
型号

序列号

泵
型号

序列号

柱温箱
型号

序列号

检测器
型号

序列号

5-3 检定设备
仪 器
有效期
备注
秒表

设备编号：
确认机构：
证书编号:
分析天平

电子天平 设备编号:
确认机构：
证书编号:
数字温度计

设备编号:
确认机构：
证书编号:
5-4标准物质
名 称
编号
有效期
萘-甲醇溶液

紫外分光光度计溶液标准物质

5 校验要求及结果

5-5-1 外观的检定
仪器型号

日期

检定员

复核员

检查项目
检查结果
仪器上是否有清晰的名称

仪器上是否有清晰的型号

仪器的旋钮，按键，开关是否正常

仪器输液的接头是否紧密，牢固

仪器在规定的压力范围有无泄漏

结论

5-5-2 输液系统的检定
5-5-2-1泵流量设定值误差和流量稳定性误差的检定
以100%甲醇为流动相，流量为1ml/min该流速，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗校验过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地记录规定体积的相应收集时间。计算泵流量设定值误差SS和流量稳定性误差的检定SR。结果按下式计算：
SS=（FM-FS）/FS×100%
SR=（FMAX-FMIN）/F平均×100%
FM= V/t
式中： SS——流量设定值误差（%）
FS——流量设定值（ml/min）
V ——收集流动相的体积（ml）
t ——收集流动相的时间（min）
SR——流量稳定性误差（%）
FMAX——同一组测量中流量最大值（ml/min）
FMIN——同一组测量中流量最小值（ml/min）
F平均——同一组测量值的算术平均值（ml/min）
泵流量设定值误差和流量稳定性误差测量要求及标准
流量设定值（ml/min）
0.5
1.0
3.0
测量次数
3
3
3
收集流动相时间（min）
8
6
4
允许误差
SS
5%
3%
2%
SR
3%
2%
2%

泵流量设定值误差及流量稳定性误差的检定记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

泵流量设定值误差及流量稳定性误差接受标准：
泵流量设定值的误差SS ： <± (2%~ 5%)
流量稳定性误差SR： <± 2%~ 3%)
流动相
甲醇
流动相密度r
0.791 g/cm3
FS
FS= 0.5 ml/min
FS= 1.0 ml/min
F3= 3.0 ml/min
t

W容量瓶

W容量瓶+W流动相

V(ml)

Fm

Fmean

S S

SR

结论

5-5-2-2 梯度准确度的检定
设置溶剂梯度程序。A溶液为水，B溶液为含0.1%丙酮的水溶液。A从100%变为0。先以A溶液走基线，(流动相不通过色谱柱)，基线平稳后执行梯度程序，画出梯度变化曲线，并读出在每个测量点的信号值。重复测量两次，求平均值。从B溶液的含量及相对应的信号值Lmi 和Lm计算梯度准确度GCi。GCi最大值为仪器梯度准确度误差。计算公式如下：
GCi = (Lmi –Lm) / Lm x 100%
式中： GCi = 第i段梯度准确度; Lmi = 第i段输出信号或记录仪的读数;
Lm = 各段输出信号或记录仪读数总均值.

梯度准确度的检定记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

梯度准确度误差接受标准：梯度准确度误差GCi ：< 3%
流动相A
水
流动相B
0.1%丙酮水溶液
F=3.0ml/min
B 溶液的变化范围
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Time

记录仪
读数
1

2

Lm

Lm(maen)

GCi(%)

结论

5-5-3 柱温箱温度控制系统的检定
5-5-3-1 柱温箱温度设定值误差DTs 与控温稳定性误差TC
选择最低使用温度(20°C)和最高使用温度(60°C)进行检定，待指示温度稳定后，每隔10分钟记录一次，共计7次，求出算术平均值。设定值与平均值之差为DTs，7次测量值中最大值与最小值之差为控温稳定性误差TC。
柱温箱温度控制系统的检定记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

柱温箱温度控制系统的接受标准：
柱温箱温度设定值误差DT : < ±2°C
控温稳定性误差TC ： £ ±1°C
TS1 (°C)
20

Tm1
No
1
2
3
4
5
6
7
平均
读数

DT2

TC1

TS2 (°C)
60
Tm2
No
1
2
3
4
5
6
7
平均
读数

DT2

TC2

结论

5-5-4 检测器
5-5-4-1 基线漂移和基线噪声检定
使用如下色谱条件：色谱柱：C18，检测波长为254nm，流动相为100%甲醇，流速为1.0ml/min。待基线稳定后，记录基线30分钟，计算基线漂移和噪声。
基线噪声及基线漂移检定记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

基线噪声及基线漂移接受标准：
基线噪声： £5×10-4（AU）
基线漂移： £5×10-3（AU/h）
色谱柱

流动相

流速

检测波长

基线噪声（AU）

基线漂移测定值

结论

5-5-4-2 最小检测浓度
在测定仪器的基线噪声的条件下，注射20ul浓度为1×10-7g/ml的萘-甲醇溶液，记录样品峰高。在其样品峰高大于或等于两倍基线噪声峰高时，计算最小检测浓度公式如下：
CL=2·HN·C/H
式中: CL——最小检测浓度（g/ml）
HN——噪声峰高（记录仪格数或实测高度mm）
C——样品浓度（g/ml）
H——样品峰高（记录仪格数或实测高度mm）
最小检定浓度检定记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

最小检测浓度接受标准：
最小检测浓度： 4×10-8g/ml(萘的甲醇溶液)
样品浓度

噪声值

峰高

最小检测浓度

结论

5-5-4-3波长示值误差
用水将流动池冲洗干净, 置零。用0.0005mol/l硫酸溶液冲洗流动池，并将其注满。设定流速为0.5ml/min, 检测器波长为200nm。测定其从200nm到400nm条件下的紫外吸收值。(在规定的标准波长(235nm, 257nm, 313nm, 350nm)周围正负5nm范围内每1nm测试1次，测试范围应含括200nm,及400nm两点)记录相应的紫外吸收值或峰高。用0.006%重铬酸钾标准溶液清洗流动池，并将其注满。设定检测器波长为200nm, 进样20ul/min。测定其从200nm到400nm条件下的紫外吸收值。记录相应的紫外吸收值或峰高。重复3次。扣除空白后的极点吸收值对应的波长与标准波长间的差为波长示值误差。3次测量中 最大值与最小值之差为波长重复性误差。
波长示值误差及波长重复性误差的检定记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

波长误差接受标准：
示值误差 ： £± 2nm
重复性误差： £± 1nm
标准波长
235nm
257nm
313nm
350nm
测定值
1

2

3

平均值

示值误差

重复性误差

结论

5-5-4-4 线性范围的鉴定
将仪器连接好, 检测波长选在254nm,待仪器稳定后,用注射器直接向检测池中注射2%异丙醇/水溶液冲洗检测池.之后,依照上法,分别注入丙酮/2%异丙醇系列水溶液(丙酮含量为0.1%, 0.2%, 0.3%,……, 1.0%)冲洗检测池, 并记录各溶液对应的稳定读数, 每个溶液重复测定3次, 取算术平均值. 以5个丙酮含量(0.1%--0.5%供5个点)和对应的读数做标准曲线, 在曲线上找出丙酮含量大于0.5%各点的读数, 与对应含量的测量值做比较, 测量值低于读数5%时认为曲线弯曲, 此点的浓度作为检测上限CH. 按下式算出CL, 由CH/CL算出检测器的线性范围.
CL=2Nd C ×20/HV
其中:
CL------最小检测浓度, g/ml
Nd------基线噪声峰—峰高, mm
C------标准溶液的浓度, g/ml
H-----标准溶液的色谱峰高,mm
V------进样体积, ul

仪器型号

日期

检定员

复核员

线性范围接受标准：
>103
线
性
范围
丙酮%
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0

读数

平均值

线性范围

结论

5-5-5手动进样器进样线性
使用适当的萘-甲醇标准溶液或稳定的待分析样品，以甲醇为流动相，波长设定为254nm，分别进样5ul、10ul、15ul、20ul，至少进样2针。记录萘的峰面积，计算其平均峰面积相对于进样量的线性回归。
仪器型号

日期

检定员

复核员

自动进样器相对准确度接受标准：
相对准确度RA ：<± 2%
V
1
2
3
4
5
A平均
RSD%
5ul

10ul

15ul

20ul

线性方程

结论

5-5-6 定性，定量测量重复性的检定
使仪器处于正常工作状态，注入适当的萘-甲醇标准溶液或稳定的待分析样品，记录保留时间和峰面积，连续测定6次，按如下公式计算RSD%。
RSD定性（定量）=[∑（XI-X平均）2/(n-1)]0.5/X平均×100%
式中：XI——第i次测得的保留时间或峰面积
X平均——n次测量结果的算术平均值
I——测量序号
n——测量次数
定性，定量测量重复性的检定的记录
仪器型号

日期

检定员

复核员

定性，定量测量重复性接受标准
定性测量重复性误差RSD定性： £1.5%
定量测量重复性误差RSD定量： £3.0%
试样名称

浓度

进样量

波长

流动相

流量

No
1
2
3
4
5
6
平均
保留时间 (min)

峰面积

定性重复性结果

定量重复性结果

结论
定性重复性与定量重复性符合要求
6.附图
a. 定性，定量测量重复性的检定色谱图
b. 自动进样器线性图谱
c. 波长示值误差图谱
d. 梯度误差图谱
e. 基线噪声和基线漂移

附录1： HPLC检定证书
检定结果
B.1外观检查:
B.2泵流量设定误差和重复性误差:
泵流量设定值/(ml/min): 0.5 1.0 1.5
实测值/(l/min):
设定误差Ss/%:
重复性误差SR/%:
泵梯度误差Gc/%:
B.3 柱箱温度设定值误差△Ts:
柱箱温度稳定性Tc:
B.4 检测器性能:
基线噪声/AU:
基线漂移/(AU/h):
波长示值误差/nm:
最小检测浓度/(g/ml萘/甲醇):
线性范围:
B.5 整机性能
定性重复性RSD6/%:
定量重复性RSD6/%:

审核人/日期: 复核人/日期 : 检定人/日期:

附录2：色谱柱性能测试
A.1 液相色谱柱性能
A.1.1柱效：
反相色谱柱的理论塔板数一般在3×104～4×104m-1范围内，正相色谱柱的理论塔板数在4×104～5×104m-1范围内.
A.1.2色谱峰对称性：被测物（蒽）的不对称因子As一般在0.8～1.6范围内.
A. 2柱性能测试方法
A.2.1测试条件和标准溶液
色谱柱性能测试条件和液相色谱仪的检定条件基本相同.
反相色谱柱侧使用的标准溶液为10g/ml尿嘧啶,10g/ml联苯和蒽(萘)的甲醇溶液,正相色谱柱测试用的标准溶液为10ml/ml甲苯和10ml/ml硝基苯的正己烷溶液.
A.2.2 柱效的测试方法:
将被测试的色谱柱接到检定合格的液相色谱仪器上,反相柱用甲醇+水(85%+15%)为流动相,内径为4.6mm时,流速为1.0ml/min,紫外检测波长为254nm,灵敏度选择在0.04左右,按色谱柱说明书操作,开启仪器稳定后,从进样口注入10ul反相柱测试标准溶液,记录色谱图,重复进样3次,取平均值.
n=5.54×(tR/Wh/2)×1000/L
式中:n----理论塔板数;
tR--------色谱峰的保留时间,min;
Wh/2-----------色谱峰半高峰宽,min;
L-------色谱柱长,mm.
正相色谱柱的柱效测试条件和方法与反相柱基本相同,只是流动相为正己烷/异丙醇(99.5%+0.5%),注入正相色谱柱测试标准溶液.
A.2.3色谱峰对称性的计算
As=b/a
式中:a,b分别为通过1/10h峰高处,平行于峰底的直线被峰两侧及峰高截取的两线段的长度.
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