抗CCL20单克隆抗体对血清淀粉样蛋白A相关的结节病中促炎性细胞因子的抑制作用.pdf

论著(基础研究)抗 CCL20 单克隆抗体对血清淀粉样蛋白 A 相关的结节病中促炎性细胞因子的抑制作用魏 佳,马成星,郑 颖,那雨琪,丁晶晶 摘要 目的 探讨抗 CCL20 单克隆抗体是否可抑制高水平血清淀粉样蛋白 A(SAA)相关的结节病外周血单个核细胞(PBMC)中促炎性细胞因子的表达。方法提取健康人和结节病患者的 PBMC,并进行分组。除空白对照组(正常人 PB-MC)和结节病 PBMC 对照组(患者 PBMC)外,另将结节病组 PBMC 中分别加入 SAA、SAA+抗 CCL20 单克隆抗体、SAA+NF-B抑制剂 BAY11-7082 或地塞米松,经培养 48 h 后收集各组细胞,分别作为 PBMC+SAA 刺激组、PBMC+SAA+NF-B 抑制剂BAY11-7082 组、PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组、PBMC+地塞米松干预组,使用 ELISA 分别测定各组细胞上清液中细胞因子 IL-17A、IL-23、IL-6、CCL20 和 TGF-1的表达,使用 RT-PCR 测定各组细胞中 CCR6、IL-17、ROR-t 和 Foxp3 的 mRNA 表达水平,使用 Western blot 检测各组细胞中 p-NF-B 和 NF-B 蛋白的表达水平。结果PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组与 PBMC+SAA组相比,细胞上清液中的 IL-17A、IL-23 和 IL-6 的水平显著降低(P0.01),而 TGF-1的含量显著升高(P0.01)。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组相较于 PBMC+SAA 组,细胞中 CCR6、IL-17A、ROR-tmRNA 水平显著降低(P0.05)。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组中 p-NF-B 蛋白表达水平较 PBMC+SAA 组明显降低(P0.01)。结论 抗 CCL20 单克隆抗体可抑制高水平 SAA 相关的结节病 PBMC 中促炎性细胞因子的表达。关键词 结节病;血清淀粉样蛋白 A;核因子 B;抗 CCL20 单克隆抗体 中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 2097-2768(2024)01-0001-06 DOI 10.16571/ki.2097-2768.2024.01.001基金项目:国家自然科学基金(82170077);南京市医药卫生科研课题(YKK20051)作者单位:210008 南京,南京中医药大学鼓楼临床医学院呼吸与危重症医学科(魏 佳、丁晶晶);210008南京,南京大学医学院附属鼓楼医院呼吸与危重症医学科(马成星);210008 南京,南京医科大学鼓楼临床医学院呼吸与危重症医学科(郑 颖、那雨琪)通信作者:丁晶晶,E-mail:dingflower Anti-CCL20 monoclonal antibody suppresses the overexpression of pro-inflammatory cytokines in sarcoido-sis accompanied by serum amyloid AWEI Jia1,MA Chengxing2,ZHENG Ying 3,NA Yuqi 3,DING Jingjing 1(1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanjing Drum Tower Hospital,Clinical College of Nan-jing University of Chinese Medicine,Nanjing 210008,Jiangsu,China;2.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanjing Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,Jiangsu,China;3.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanjing Drum Tower Hospital,Clinical College of Nanjing Medical University,Nanjing 210008,Jiangsu,China)Abstract Objective This study aims to investigate whether the anti-CCL20 monoclonal antibody inhibits the expression of pro-inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)with high levels of serum amyloid A(SAA)associated with sarcoidosis.Methods PBMCs were extracted from both healthy individuals and patients with sarcoidosis.In addition to the blank control group and the sarcoidosis PBMC controlgroup,the PB-MCs from the sarcoidosis group were separately treated with SAA,SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody,SAA+NF-B inhibitor BAY11-7082,or dexamethasone.After cell culture for 48 hours,cells from each group were collected.The expression levels of cyto-kines(IL-17A,IL-23,IL-6,CCL20,and TGF-1)in the cell su-pernatant were determined using ELISA.The mRNA expression levels 1医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024of CCR6,IL-17,ROR-t,and Foxp3 in the cells were assessed using RT-PCR.The protein expression levels of p-NF-B and NF-B in the cells were examined by Western blot.Results In the PBMC+SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody group,the levels of IL-17A,IL-23,and IL-6 in the culture supernatant were significantly decreased compared to that in the PBMC+SAA group(P0.01),while TGF-1 content was significantly increased(P0.01).In comparison to the PBMC+SAA group,the PBMC+SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody group exhibited a significant reduction in the mRNA levels of CCR6,IL-17A,and ROR-t(P0.05).The expression level of p-NF-B protein in the PBMC+SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody group was significantly lower than that in the PBMC+SAA group(P0.01).Conclusion Anti-CCL20 monoclonal antibod-y can effectively inhibit the expression of pro-inflammatory cytokines in sarcoidosis PBMCs with elevated levels of SAA.Key words sarcoidosis;serum amyloid A;nuclear factor B;anti-CCL20 monoclonal antibody0 引 言 结节病是一种病因不明的系统性炎症性疾病,可累及体内几乎所有的器官,其典型病理特征是非干酪样肉芽肿的形成1。结节病以中青年发病为主,平均发病年龄约为 50 岁,女性发病率略高于男性,约有 10%30%的患者表现为慢性、进展性病程,最终发生不可逆的肺纤维化2-3。目前,临床上尚缺乏结节病的特异性检验标志物和有针对性的治疗方法,这使得对结节病的管理仍然具有挑战性4。血清淀粉样蛋白 A(serumamyloid A,SAA)是一种由肝脏合成的急性时相反应蛋白,在结节病的肉芽肿组织和外周血中异常增高5-6。SAA 可以上调趋化因子配体 20(C-C motif chemokine ligand 20,CCL20)的表达,CCL20 是一种趋化因子,可选择性地吸引树突状细胞、效应/记忆 T 淋巴细胞和幼稚 B 细胞,其通过结合和激活趋化因子受体 6(che-mokine receptor 6,CCR6),诱导 Treg 细胞和 Th17 细胞的迁移7-8。结节病中存在 CCR6/CCL20 趋化因子轴异常激活,CCR6 在结节病肺组织中的 Th17 淋巴细胞上高表达,并通过其与配体 CCL20 的相互作用而调节 Th17 细胞的功能9-10。抗 CCL20 单克隆抗体可通过与淋巴细胞中的 CCR6 结合,纠正失衡的 Th1/Th2 与 Th17/Treg 细 胞 反 应11。但 抗CCL20 单克隆抗体对结节病外周血单个核细胞(pe-ripheral blood mononuclear cells,PBMC)中 Th17 相关的免疫紊乱是否有作用,其作用机制是否与 SAA的高表达相关,目前尚不明确。本研究旨在探讨抗CCL20 单克隆抗体是否能缓解结节病 PBMC 中Th17 相关的的促炎性细胞因子的表达,且其作用是否与高水平的 SAA 作用相关,以便于更深入地了解结节病的发病机制,为其治疗提供支持。1 材料与方法1.1 主要仪器与试剂人淋巴细胞分离液(索莱宝,P8900-200),SAA(SIGMA,SRP4324),BAY11-7082(BAY),CCL20 单抗(RD,AF360-SP),地塞米松(凯基,KGP11100)。人 TGF-1 ELISA 试剂盒(批号:EH010-48),人 IL-23ELISA 试剂盒(批号:EH035-48),人 IL-6ELISA 试剂盒(批号:EH004-48),人 IL-17A ELISA 试剂盒(批号:EHC170.48),人 CCL20 ELISA 试 剂 盒(批 号:HM10367),人HMGB1 ELISA 试剂盒(批号:SEA399Hu)。Trizol(Aidlab,252250AX),HiScript Q RT SuperMix for qPCR(Q223-01),ChamQ Universal SYBR qPCR Mas-ter Mix(Q711-02)购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。RORt Antibody(Abcam,ab113434),p-STAT3 Antibody(Abcam,ab76315),p-p85 Antibody(CST,4228T),-actin Antibody(Abcam,ab8226),HRP 标记二抗(碧云天),RIPA 细胞快速裂解液(Solarbio,R0010),BCA 蛋白定量试剂盒(Thermos,PICPI23223),蛋 白 预 染Marker(Fermentas,SM1811)。引物序列见表 1。表 1 RT-PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-PCR基因序列CCR6 ForwardCTGTGCTCTATGCTTTTATTGGG ReverseCATTGTCGTTATCTGCGGTCTCIL-17A ForwardCAGACTACCTCAACCGTTCCAC ReverseTCCAGCTTTCCCTCCGCATTGAROR-t ForwardTACCTTGGCCAAAACAGAGG ReverseGATGCCTGGTTTCCTCAAAAFoxp3 ForwardCCTGGTTGTGAGAAGGTCTTCG ReverseTGCTCCAGAGACTGCACCACTTGAPDH ForwardGGAGCGAGATCCCTCCAAAAT ReverseGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG1.2 细胞分组与培养1.2.1PBMC的提取取正常人与结节病患者静脉血各 6 份,每份 20 mL 置于抗凝管内,于 2 h 内2医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024分离获取 PBMC,步骤如下:将 20 mL 全血置于 50 mL 无菌离心管内,加入等体积的 1PBS,混匀。取 15 mL 无菌离心管 8 支,各管内加入 5 mL 淋巴细胞分离液。分别取 5 mL 稀释的全血缓慢加入各管淋巴细胞分离液中,切勿破坏液面。室温下以离心半径 10 cm、2000 r/min 离心 20 min。离心后管内分成上中下 4 层,小心吸取上中层界面中间的白色云雾层,即为 PBMC。吸取 PBMC 至灭菌离心管中,使用 1PBS 洗涤,以离心半径 10 cm、室温下 1000 r/min 离心 10 min 后弃去上清,重复清洗两次。正常人与结节病患者 PBMC 由南京鼓楼医院提供,伦理号(2016-138-01)。1.2.2PBMC的分组与处理将所提取的 PBMC以每孔 1105/cm2接种于 6 孔板中,并进行如下分组(n=6):空白对照组:即正常人 PBMC;PBMC对照组:即患者 PBMC;PBMC+SAA 刺激组:患者PBMC 中加入 5 g/mL SAA 进行共培养;PBMC+SAA+NF-B 抑制剂 BAY11-7082 组:患者 PBMC 中加入 5 g/mL SAA 和 1 ng/mL BAY11-7082 进行共培养;PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组:患者 PBMC中加入 5 g/mL SAA 和 0.5 ng/mL 抗 CCL20 单抗进行共培养;PBMC+地塞米松干预组:患者 PBMC中加入 1 mol/L 地塞米松进行共培养。各组细胞置于含有 1%的青霉素链霉素以及 20%胎牛血清(FBS)的 DMEM 培养基中,37、5%CO2的培养箱中分别培养 48 h。1.3酶联免疫吸附实验检测 IL-17A、IL-6、IL-23、CCL20 及 TGF-1水平收集各组细胞上清培养液,随后按照试剂盒说明书分别检测与 Th17 细胞相关的促炎性细胞因子 IL-17A、IL-6、IL-23、CCL20 及TGF-1的水平,使用多功能酶标仪于 450nm 处测定吸光度,实验重复进行 3 次。1.4逆转录定量 PCR(RT-qPCR)使用 Trizol(Aidlab)从各组细胞中提取总 RNA。按反转录试剂盒说明书,以总 RNA 为模板,将 mRNA 反转录为cDNA,反应条件为50 15 min,85 5s。以 cDNA为模板构建 PT-PCR 反应体系,95 30 s,95 10 s,60 30 s,40 个循环,引物序列见表 1。用 GAP-DH 作为内参,采用 2-ct法计算 mRNA 的表达量。1.5 蛋白质免疫印迹检测 收集培养 48 h 后的各组细胞,用含有 1%PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞,提取蛋白。使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。进行上样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育过夜(p-NF-B-p65 稀 释 比 为 1 1000,-actin 稀 释 比 例 为1 5000),TBST 缓冲液洗涤 3 次,每次 5 min;与HRP 标记的二抗(15000)室温孵育 1 h,TBST 洗涤3 次后,用 ECL 发光液进行曝光,用 ImageJ 软件分析条带的灰度值。实验重复进行 3 次。1.6统计学分析采用 GraphPad Prism 9.0 统计进行统计分析,定量资料以均数标准差(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,使用 Tukey 检验方法进行两两比较。以 P0.05 为差异具有统计学意义。2 结 果2.1SAA 对结节病 PBMC 中 Th17/Treg 相关细胞因子水平的影响各组 PBMC 在 48 h 培养后的上清液中,PBMC 对照组的 IL-17A、IL-23 和 CCL20的水平较空白对照组显著升高(P 0.01)。而PBMC+SAA 组的 IL-17A、IL-23、IL-6 和 CCL20 的水平较 PBMC 对照组显著升高(均 P0.01)。此外,PBMC 对照组中与 Treg 相关的 TGF-1浓度较空白对照组下降(P0.05),而 PBMC+SAA 组中的 TGF-1浓度较 PBMC 对照组下降(P0.05)。PBMC+SAA 组的 CCR6、IL-17A、ROR-t 的转录水平较 PBMC 对照组显著升高(均 P0.01),而 Foxp3 的转录水平较 PBMC 对照组显著降低(P0.01)。见图 2。2.2抗 CCL20 单克隆抗体对高水平 SAA 相关的结节病 PBMC 中促炎性细胞因子的影响各组PBMC 在 48 h 培养后的上清液中,PBMC+SAA+抗CCL20 单抗组的 IL-17A、IL-23 和 IL-6 的水平较 PB-MC 对照组显著增加(均 P0.01),TGF-1的水平较 PBMC 对照组显著下降(P0.01)。其 IL-17A、IL-23 和 IL-6 的水平较 PBMC+SAA 组显著下降(均P0.01),而 TGF-1的含量显著增加(P0.01)。PBMC+SAA+BAY11-7082 组的 IL-17A、IL-23、IL-6和 CCL20 的水平较 PBMC 对照组和 PBMC+SAA 组均显著降低(均 P0.01),TGF-1的浓度相对于PBMC 对照组和 PBMC+SAA 组有不同程度的升高(P0.05,P0.01)。PBMC+地塞米松组相比于PBMC 对照组和 PBMC+SAA 组,其 IL-17A、IL-23 和IL-6 的含量显著降低(均 P0.01),TGF-1的含量显著升高(均 P0.01);地塞米松对 IL-17A 和 IL-6的抑制作用优于抗 CCL20 单抗,低于 BAY11-7082,其对于 IL-23 的抑制作用与 BAY-11-7082 类似。见图 1。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组的 IL-17 mRNA3医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024水平较 PBMC 对照组升高(P0.01),而 Foxp3 mR-NA 水平较 PBMC 对照组降低(P0.05)。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组相较于 PBMC+SAA组,细胞中 CCR6、IL-17A、ROR-t 的转录水平显著降低(均 P0.05)。PBMC+SAA+BAY11-7082 组ROR-t mRNA 较 PBMC 对照组升高(P0.05)。PBMC+地塞米松组中 IL-17A 的表达水平较 PBMC对照组和 PBMC+SAA 组显著降低(均 P0.05),较 PBMC+SAA 组明显下降(均 P0.01),而 Foxp3 mRNA 水平较 PBMC 对照组和 PBMC+SAA 组均显著增高(P0.01)。见图 2。2.3 抗 CCL20 单克隆抗体对 NF-B 信号通路及其由高水平 SAA 所致的结节病 PBMC 中促炎性细胞因子的影响 PBMC 对照组中 p-NF-B 蛋白表达水平较空白对照组增高(P0.01),明显低于 PBCM+SAA 组中(P0.01)。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组中 p-NF-B 蛋白表达水平较 PBMC 对照组增高(P 0.01),而较 PBMC+SAA 组明显降低(P 0.01)。PBMC+SAA+BAY11-7082 组中 p-NF-B 蛋白表达水平明显低于 PBMC+SAA 组(P0.01)。PBMC+地塞米松组中 p-NF-B 的表达水平显著低于 PBMC 对照组和 PBMC+SAA 组(P0.05)。见图 3。1:空白对照组;2:PBMC 对照组;3:PBMC+SAA 组;4:PBMC+SAA+NF-B 抑制剂 BAY11-7082 组;5:PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组;6:PBMC+地塞米松干预组与空白对照组比较,P0.05、P0.01;与 PBMC 对照组比较,#P0.05、#P0.01;与 PBMC+SAA 组比较,P0.05、P0.01图 1 ELISA 检测培养 48 h 不同组 PBMC 培养上清中 IL-17A、IL-23、IL-6、CCL20、TGF-1的含量Figure 1ELISA to detect the levels of IL-17A,IL-23,IL-6,CCL20,and TGF-1 in culture supernatants of different groups of PBMC incubated for 48 h 1:空白对照组;2:PBMC 对照组;3:PBMC+SAA 组;4:PBMC+SAA+NF-B 抑制剂 BAY11-7082 组;5:PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组;6:PBMC+地塞米松干预组与空白对照组比较,P0.05、P0.01;与 PBMC 对照组比较,#P0.05、#P0.01;与 PBMC+SAA 组比较,P0.05、P0.01图 2 RT-PCR 检测不同组 PBMC 中 CCR6、Foxp3、IL17A、RORt 的转录水平Figure 2 RT-PCR to detect the transcript levels of CCR6,Foxp3,IL17A and RORt in different groups of PBMCs4医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024 1:空白对照组;2:PBMC 对照组;3:PBMC+SAA 组;4:PBMC+SAA+NF-B 抑制剂 BAY11-7082 组;5:PBMC+SAA+抗CCL20 单抗组;6:PBMC+地塞米松干预组与空白对照组比较,P0.05、P0.01;与 PBMC 对照组比较,#P0.05、#P0.01;与 PBMC+SAA 组比较,P0.05、P0.01图 3 Western blot 检测不同组 PBMC 中 p-NF-B、NF-B的蛋白表达水平Figure 3 Western blot to detect the protein expression lev-els of p-NF-B,NF-B in different groups of PBMC3 讨 论 结节病是一种全身性炎症性疾病,其免疫学特征为固有免疫系统的激活,表现为活化的巨噬细胞分化为类上皮样细胞并融合形成巨细胞;以及适应性免疫系统的激活,尤其是 Th1 和 Th17 细胞的活化12。SAA 作为一种调节固有免疫反应的效应因子,与多种慢性炎症性疾病有关13。与健康人相比,结节病患者的血清 SAA 水平升高,且发生肺纤维化的结节病患者的血清 SAA 水平明显高于未发生纤维化的患者14。SAA 通过激活 Toll-2 受体而刺激结节病中巨噬细胞对 NF-B 的高表达,并促进结节病肉芽肿的形成15-16。本课题组之前的研究表明,SAA 通过促进结节病肺泡灌洗液和血清中CCL20 和 IL-17A 的产生与释放,在 Th17 细胞相关的免疫反应中发挥促炎作用17。在结节病中,由巨噬细胞产生的 CCL20 是一种促炎性趋化因子,直接受到转录因子 NF-B 的调控。CCL20 可诱导结节病肺组织中的炎症反应,加剧病情的进展9;同时,CCL20 招募的 CCR6+Th17 细胞在结节病肺组织中引发炎症反应并参与了肉芽肿的形成18。在本研究中,高水平的 SAA 除了导致结节病PBMC 中 CCR6/CCL20 趋化因子轴异常活化,还促使 Th17 细胞相关的促炎性细胞因子 IL-17、IL-6、IL-23 和 ROR-t 高度表达,同时抑制了与 Treg 相关的TGF-、Foxp3 的表达。NK-B 抑制剂 BAY11-7082特异性阻断由 SAA 刺激所致的结节病 PBMC 中CCR6/CCL20 趋化因子轴的异常活化,抑制 Th17 细胞相关的促炎性细胞因子的生成,并促进 Treg 细胞功能恢复。抗 CCL20 单克隆抗体对结节病 PBMC的作用与 BAY11-7082 类似,可部分抑制由高水平SAA 引起的结节病 PBMC 中 Th17 相关的促炎性细胞因子的表达,促进 Treg 细胞的免疫抑制能力恢复,但其效果低于 BAY11-7082。在结节病小鼠肺组织中,抗 CCL20 单克隆抗体可改善肺部肉芽肿中SAA 的高表达,并纠正结节病肺组织和淋巴结中失衡的 Th1/Th2 与 Th17/Treg 细胞反应17。在本研究中,CCL20 单克隆抗体虽能抑制由 SAA 刺激所造成的结节病 PBMC 中 Th17 细胞相关的促炎性细胞因子的高表达,但并未抑制结节病 PBMC 中 Th17细胞相关的炎症反应。对于抗 CCL20 单克隆抗体在结节病 Th17 细胞中的作用,需要体内实验进一步验证。在体外实验中,由痤疮分枝杆菌(MAB)细胞壁微粒刺激形成的结节病肉芽肿较结节病 PBMC中的 NF-B 与 p-NF-B 水平均显著升高并且与高度活化的 T 细胞免疫相关19;而在本研究中,抗CCL20 单克隆抗体可抑制 SAA 高表达所造成的结节病 PBMC 中异常活化的 NF-B 信号通路,从而改善由 SAA 造成的结节病中促炎性细胞因子的高表达,但抗 CCL20 单克隆抗体并未抑制结节病 PBMC中 NF-B 的磷酸化水平,这可能与本研究中的实验对象仅为结节病 PBMC,其促炎性细胞因子水平低于结节病肺组织和由结节病 PBMC 诱导形成体外肉芽肿有关19-20。总之,本研究表明,抗 CCL20 单克隆抗体可改善 SAA 高表达所致的结节病 PBMC 中的 Th17/Treg细胞紊乱,但未能纠正结节病 PBMC 中的 Th17/Treg 失衡,这可能与抗 CCL20 单克隆抗体对结节病不同病变部位的作用效果不同有关。【参考文献】1 Sve P,Pacheco Y,Durupt F,et al.Sarcoidosis:A Clinical O-verview from Symptoms to DiagnosisJ.Cells,2021,10(4):5医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024766.2 Belperio JA,Shaikh F,Abtin FG,et 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