杨梅素经β-catenin对厄洛替尼抗非小细胞肺癌的增敏作用与机制.pdf

基金项目：山东省自然科学基金（；）通信作者：杨春燕，：杨梅素经 对厄洛替尼抗非小细胞肺癌的增敏作用与机制宋鹏李敏敬杨春燕滨州医学院医药研究中心山东 烟台 ；滨州医学院中医学院山东 烟台 ；滨州医学院口腔医学院口腔生物学教研室山东 烟台 【摘要】目的探讨杨梅素经 对厄洛替尼抗非小细胞肺癌（）的增敏作用及分子机制。方法将 细胞分为对照组、厄洛替尼处理组、杨梅素处理组，采用 方法检测 随时间和剂量的表达情况。构建 转染 细胞敲降 的细胞株，应用集落形成实验，观察厄洛替尼处理后集落形成率。构建厄洛替尼和杨梅素单独处理组和联合处理组，实验检测细胞凋亡状况，检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果厄洛替尼可显著诱导 细胞中 的表达，并呈时间和剂量依赖效应，抑制 可增强 细胞对厄洛替尼的敏感性。杨梅素可显著抑制 的表达。与厄洛替尼单独应用比较，杨梅素和厄洛替尼联合应用显著提高 细胞凋亡率，增强凋亡相关蛋白的表达量。结论杨梅素通过下调 表达促进厄洛替尼抗 的敏感性，为杨梅素和厄洛替尼联合应用抵抗厄洛替尼的耐药性提供了实验依据和新的治疗思路。【关键词】人非小细胞肺癌；厄洛替尼；杨梅素【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，；，；，【】，【】；非 小 细 胞 肺 癌（，）是常见的恶性肿瘤之一，占肺癌发病总数的滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，以上，其患者 年生存率不到 。表皮生长因子受体（，）靶向药物厄洛替尼（）在临床上应用于晚期 的二、三线治疗 ，但肿瘤耐药成为限制厄洛替尼疗效的关键问题。因此，晚期 厄洛替尼耐药机制及耐药后的治疗策略已成为研究热点。基因扩增 、大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（，）基因突变 、胰岛素样生长因子 受体（，）活化 及 突变 与厄洛替尼耐药相关，但仍有部分厄洛替尼耐药机制不明 。长期使用厄洛替尼可导致 及其相关分子 、基质金属蛋白酶（，）上调，诱发厄洛替尼耐药 。体外实验证实，抑制 可降低 对吉非替尼耐药 。这提示，通路可能在厄洛替尼耐药过程中发挥重要作用。杨梅素（）是从杨梅树树皮、树叶中提取的一种黄酮醇类化合物，具有镇痛、抗过敏和抗炎症的作用 。杨梅素可下调结直肠癌细胞中 的表达，抑制下游 信号传导，从而诱导肿瘤细胞凋亡 。杨梅素可抑制人乳腺癌细胞 的表达，进而影响乳腺癌病程 。杨梅素调节 信号通路的分子机制至今不明，尚待进一步研究。杨梅素被美国 批准可应用于医药、食品等行业，这为杨梅素作为临床抗癌药物使用提供了有利条件 。在 细胞中，杨梅素可以抑制 表达。本研究拟探讨杨梅素调控 通路的分子机制，并研究抑制 在提高 对厄洛替尼敏感性中的机制，有助于挖掘杨梅素的抗癌机理及厄洛替尼的耐药机制，并开发改善厄洛替尼等靶向药物疗效。杨梅素与厄洛替尼联合使用的治疗方案有可能成为晚期 治疗的新策略，具有潜在的应用价值。材料与方法 材料 细胞株 购自普诺赛生命科技有限公司。由广州锐博生物科技有限公司合成人 的 、购自 公司。杨梅素生化试剂、（）购自北京索莱宝公司（货号为 ）。胎牛血清购自 公司（货号为 ）。（货 号 为 ）、（货号为 ）购自 公司。（货号为 ）、（货号为 ）、（货号为 ）、（货号为 ）购自 公司。购自 公司（货号为 ）。实验方法 细胞培养 细胞使用含 胎牛血清，青霉素和链霉素的 培养基作为细胞培养液，培养条件为 ，细胞培养箱中培养，每 更换一次培养基。细胞经不同浓度杨梅素（、）处理 ，杨梅素处理 、后分别收集部分细胞提取蛋白。的化学合成及转染由广州锐博生物科技有限公司合成针对人 以及阴性对照序列。其中 的 序列为 ；阴 性 对 照 序列为 。转染前细胞密度控制在 左右，采用脂质体转染试剂 转染 ，最终浓度为 。检测蛋白表达水平根据收集细胞的数量进行 裂解液的裂解，提取细胞总蛋白，并用 法定量。将裂解物在 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液中煮沸 ，取 左右蛋白进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到 膜，用封闭液封闭，然后与一抗孵育，洗膜，继之与二抗孵育，洗膜，采用 化学发光试剂检测蛋白的表达量。集落形成实验胰酶消化细胞，制备细胞悬液，每孔 个细胞接种于 孔板中，使细胞分散均匀。培养 后分别对 细胞加入 、厄洛替尼进行处理，然后将细胞继续培养 周，厄洛替尼处理 、后分别收集部分细胞提取蛋白。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。甲醇固定 ，加适量姬姆萨应用液染色 。光学显微镜下采集图像，应用 成像系统（，）统计集落的数量及大小。实验将 细胞接种于 孔板中，并进行相应的处理。与 按照 的比例配置成工作液浓度，将 工作液加入 孔板中 孵育 ，然后弃去工作液，并用 清洗 次，用荧光显微镜观察，亮蓝色的即为凋亡细胞。滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，统计学方法采用 和 软件。定量数据以（珋）表示，检验和 检验用于两组或多组间显著性差异的比较。为差异有统计学意义。结果 厄洛替尼诱导 的表达分别以时间梯度和浓度梯度的厄洛替尼处理 细胞，检测厄洛替尼对 表达的影响，结果发现，厄洛替尼上调 细胞中 的表达，并呈时间和剂量依赖性（图 ）。厄洛替尼处理 细胞 或 厄洛替尼处理 细胞 ，检测 表达，作为内参；、蛋白表达量的定量统计。与作用时间为 ，厄洛替尼不添加组比较，。图 检测厄洛替尼诱导 表达情况 敲降 后 细胞对厄洛替尼敏感性的影响 不但与肿瘤的发生发展密切相关，还介导肿瘤的耐药。厄洛替尼处理细胞后，表达升高，这可能是细胞的代偿性反应，与细胞对厄洛替尼的敏感性有关。本研究采用小干扰 敲降 表达，显示，成功敲降 细胞中 的表达。集落形成结果表明，敲降 表达显著降低 细胞集落形成能力，与对照细胞比较，表达受抑制的细胞在用厄洛替尼处理后集落形成率显著降低（图 ）。免疫印迹检测 、转染构建的 敲降细胞系；上述细胞用厄洛替尼处理后的集落形成率检测。柱状图显示集落形成 个复孔的数量统计值。与 组比较，。图 抑制 表达后集落形成实验检测细胞对厄洛替尼的敏感性 杨梅素对 表达作用的影响本研究进一步检测杨梅素对 细胞株中 表达的影响，结果发现，细胞经杨梅素 处理 范围内的 表达量降低，并于 后显著降低，呈现时间依赖性。细胞经不同浓度杨梅素（、）处理 后，滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，的表达显著降低，并呈剂量依赖性（图 ）。杨梅素处理 细胞 或 杨梅素处理 细胞 ，表达检测，作为内参；、对蛋白表达量的定量统计。与作用时间为 或杨梅素添加量为 的对照组比较，。图 杨梅素影响 表达的检测 杨梅素对厄洛替尼促进 细胞凋亡的增敏作用 细胞经过杨梅素、厄洛替尼或两者联合处理，用 染色方法来检测细胞的凋亡率，用 检测与凋亡相关蛋白表达水平。研究发现，与杨梅素或厄洛替尼单独处理组比较，杨梅素、厄洛替尼联合处理组中 细胞的凋亡比率升高，。与杨梅素或厄洛替尼单独处理组比较，杨梅素、厄洛替尼联合处理组中凋亡相关蛋白（、）表达量升高，。见图 。这提示，杨梅素可能通过抑制 的表达增强厄洛替尼对非 的敏感性。细胞经过厄洛替尼（）、杨梅素（）或两者叠加处理 ，染色检测，蓝色高亮代表凋亡细胞；对 中凋亡细胞占总细胞数的比例进行柱状图分析；检测以上分组中 和 的表达。与厄洛替尼单独用药组比较，。图 细胞 ，凋亡相关蛋白 检测 讨论表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（，）对 患者有显著的疗效，但是其耐药性限制了 的长期疗效。本研究发现，厄洛替尼能诱导 细胞系 中 表达升高，是增强厄洛替尼药物敏感性的关键分子。本研究首次证明，在 患者中，杨滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，梅素能够抑制 的表达，通过促进细胞凋亡的方式增敏厄洛替尼。本研究有助于深入了解厄洛替尼耐药机制和天然提取物杨梅素的抗癌机理。本研究还未应用于 动物模型，有待从体内验证杨梅素增敏厄洛替尼的效果及作用机制。在 晚期治疗厄洛替尼耐药中起重要作用。是 信号通路的关键蛋白，该通路在多种肿瘤中都有异常表达，通过调控其下游靶基因 和 促进细胞的增殖和肿瘤的发展 。在 耐药的 细胞系中，水平升高，抑制 信号传导可增强对 治疗的敏感性 。在 突变的细胞中上调和激活。突变的 优先结合和酪氨酸磷酸化 ，导致 介导的反式激活的增加。对于 突变的肺癌的发展是必不可少的 。这表明，在厄洛替尼耐药细胞系中升高，这种变化导致细胞增殖和耐药性维持。靶向 途径可能为预防肺癌发展或克服对 的耐药性提供新的策略。作为肿瘤治疗靶点缺乏有效药物。与肿瘤的发生、生长、转移、免疫等密切相关 。使用 阻断 可以减缓肝癌的进展 。使用人参皂苷 抑制 的蛋白表达和核易位，干扰 的相互作用，可以抑制胃癌前病变的发生和发展 。小分子化合物白屈菜赤碱 靶向作用于 干细胞中 ，减缓肿瘤进展 。但到目前为止，基于该靶点的抑制剂、拮抗剂等的研究大多处于临床前研究阶段，尚缺乏有效的靶向药物。并且 通路生物学功能多样，在肿瘤性疾病、非肿瘤性疾病和干细胞功能维持方面均有重要作用。因此，靶向药物的设计要充分考虑其拖把效应及毒性效应，采用 已获批药物进行新功能疗效的探索成为重要的研发路径。本研究首次发现，杨梅素可抑制 中 的表达，并呈现剂量和时间的依赖效应。杨梅素可通过调控 在肿瘤中发挥作用，例如杨梅素可通过诱导人乳腺癌中 和 蛋白表达，抑 制 等，促 进 活性，通过诱导凋亡的方式抑制 细胞活力 。本研究发现，在 厄洛替尼治疗中，杨梅素抑制 表达，显著促进 细胞凋亡，增敏厄洛替尼药效。本研究将有助于开发克服厄洛替尼耐药的新策略。杨梅素联合厄洛替尼的治疗方案有可能在一定程度上克服厄洛替尼的耐药问题，为临床上治疗 肿瘤患者提供新选择，为临床研发提供了有力的实验证据。参考文献 ，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）（上接第 页），（），（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，