乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用.pdf

北京农学院学报2 0 2 4，39（1）：37-42Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0108乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNPK的相互作用郝悦，徐胜奎，阮文科*（北京农学院动物科学技术学院，北京10 2 2 0 6）摘要：【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒，然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中，2 4h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况，再分别与pCMV-MYC-hnRNPK质粒同时转染至Vero细胞中，培养2 4h，收取细胞蛋白样，进行Co-IP试验相关步骤，用Western-blot实验进行结果呈现，得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达，通过与表达hnRNPK蛋白的质粒共转染，通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNPK之间存在相互作用，JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNPK之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNPK存在相互作用，为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路，同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础，为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。关键词：乙型脑炎；非结构蛋白；hnRNPK；免疫共沉淀；蛋白互作中图分类号：S852.65文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4）0 1-0 0 37-0 6 文献标志码：AExpression of nonstructural proteins in Japanese encephalitis virus andtheir interaction with host hnRNP KHAO Yue,XU Shengkui,RUAN Wenke*(College of Animal Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:ObjectiveJThis study aims to discuss the interaction between JEV non-structural protein NSl,NS2a,NS3,NS5 andhost hnRNP K protein,so as to study the relationship between JEV virus replication and host protein.MethodsJFirst,non-structural protein granules were constructed,and then the constructed non-structural protein plasmids were transfected intoVero cells,the protein expression was observed under fluorescence microscope for 24 h,and then simultaneously transfectedinto Vero cells with pCMV-MYC-hnRNP K plasmid,which was cultured for 24 h,and cell protein samples were collected.The relevant steps of Co-IP experiment were carried out,and the results were presented by Western-blot experiment to obtainthe test results.ResultsJThe findings demonstrated successful expression of the unstructured protein plasmid in Vero cells asper this study.Co-transfection with the hnRNP K protein-expressing plasmid,followed by co-immunoprecipitation(Co-IP)testand Western blot analysis,revealed an interaction between JEV NSl and hnRNP K.However,no interaction was observed be-tween JEV NS2a,NS3,NS5 and host hnRNP K.ConclusionThe interaction between JEV NS1 protein and host proteinhnRNP K further broadens the thinking of the study of JEV nonstructural proteins,provides a foundation for the study of thelife cycle of JEV virus in host cells,and provides a new direction for the further study of JEV replication.Keywords:encephalitis;non-structural protein;hnRNP K;Co-Immunoprecipitation;protein interaction乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE)简称乙脑，又称流行性乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒引起的自然疫源性疾病。经蚊媒传播，分布在亚洲地区，夏秋季流行。该病毒首次在日本发现，是从死收稿日期：2 0 2 3-0 7-12基金项目：北京市教委科技计划面上项目资助（KM202010020007）第一作者：郝悦，硕士研究生，主要从事动物病毒的感染与诊断研究，E-mail：h a o y u e 0 8 0 50 30 9 16 3.c o m通信作者：阮文科，副教授，主要从事动物病毒的感染与诊断研究，E-mail：r w k m a i l 16 3.c o m38于脑炎患者的脑组织中分离并鉴定的1，因此又称为日本脑炎。乙型脑炎病毒(JEV)是虫媒病毒黄病毒科的成员2 ，为单股正链RNA病毒，全长11kb，从5到3依次编码衣壳蛋白C,结构蛋白 M,囊膜蛋白E以及七个非结构蛋白NS1-NS53。在宿主的细胞浆内病毒的RNA直接起mRNA作用，直接翻译出上述蛋白，并在核糖体附着的粗面内质网上装配成熟，出芽释放至胞外4。JEV的基因组主要由5非编码区、结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区和3非编码区四部分组成5。JEV的非结构蛋白具有重要作用，JEV的NS1蛋白是糖蛋白,在其N端有糖基化位点,其在病毒蛋白分泌，病毒毒力和病毒复制方面具有重要作用。NS2A蛋白在病毒的复制、装配、释放等方面中起重要作用，并且可与其他复制复合物结合形成复合体7。NS2B与NS3通常以异源二聚体的形式存在，具有酶活性8 。NS4A是最小的多功能跨膜蛋白，具有疏水性。NS4B是黄病毒中最大的疏水性非结构蛋白。NS4A 和 NS4B蛋白能够与病毒的其他蛋白相互作用来调节病毒复制的相关过程。NS5蛋白是黄病毒中最大的非结构蛋白同时也是最保守的,其N末端具有鸟苷酸转移酶结构域，可以将病毒的RNA伪装成宿主自身RNA从而防止宿主识别，通过此种方法可以促进病毒RNA的翻译10 。HnRNPK属于hnRNP蛋白家族，是一种多功能性蛋白,其通过与核酸和蛋白相互作用参与细胞的调控转录、翻译、可变剪接、mRNA稳定性、染色质重塑、信号转导等生物学过程。hnRNPK是一种高度进化保守的DNA/RNA结合蛋白。目的基因引物Target genePrimerNS1-FNS1NS1-RNS2A-FNS2ANS2A-RNS3-FNS3NS3-RNS5-FNS5NS5-R注：小写字母为限制性内切酶位点及保护性碱基，大写字母为特异性引物Note:lowercase letters are restriction enzyme sites and protective bases,and uppercase letters are specific primers北京农学院学报HnRNPK包含KH结构域、核定位信号（NLS)和核穿梭结构域（KNS)14.15。H n RNP K 作为hnRNP家族剪接因子的成员，具有多种生物学功能,包括基因转录、翻译、mRNA 前体剪接和稳定性调节等，并且可以调节几乎所有基因表达的细胞过程16-18 。对JEV病毒从其非结构蛋白和宿主蛋白相互作用的角度进行研究，运用质粒构建，细胞转染，免疫共沉淀技术等研究宿主蛋白hnRNPK与JEV非结构蛋白之间的相互作用，为JEV在宿主内的复制机制提供了新思路。1材料与方法1.1 材料乙型脑炎病毒、表达载体pEGFP由兽药与疫病防控团队分子生物学实验室保存，trizol总RNA提取试剂购于北京兰博利德商贸有限公司，TransS-cript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、pEASY-Blunt Zero Clothing Kit、T r a n s l-T 1Phage Resistant chemically Competent Cell、鼠源GFP单抗购于北京全式金生物技术有限公司，高保真酶 2 XPhanta Flash Master Mix(Dye Plus)、产物纯化试剂盒、细胞转染试剂购于南京诺唯赞生物股份有限公司,限制性内切酶BamH1 和 Xhol 购于NEB公司，western及IP细胞裂解液、BeyoECLStar（特超敏ECL化学发光试剂盒）购于碧云天生物技术公司。1.2方法1.2.1引物设计 pEGFP-N1质粒多克隆位点设计JEV非结构蛋白的引物(表 1)。表1基因引物序列Tab.1Sequence of gene primers引物序列（5-3)Primer sequence(5-3)aggctcgagatgGACACTGGATGTGCCATTGacgggatcAGCATCAACCTGCGATCTaggctcgagatgTTTAATGGTGAAATGGTTGACacgggatccTCTCTTCTTGTTTGGGTTaggctcgagatgGGAGGCGTGTTTTGGGACacgggatccTCTCTTTCCTGCTGCGAAGaggctcgagatgGGAAGGCCTGGGGacgggatccGATGACCCTGTCTTCCTGG第39卷根据NCBI上公布的序列，针对扩增产物大小Amplification product size/bp105668118572712024年第1期郝悦等：乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNPK的相互作用1.2.2JEV病毒基因组的获取利用实验室保存的JEV病毒感染BHK细胞，待细胞出现 7 0%80%病变时，将细胞反复冻融3次，46 0 0 0 r/min离心10 min，弃去细胞沉淀取上清液得到JEV病毒液，使用 trizol试剂提取总RNA根据全式金的反转录试剂盒配置相关反应体系，在42 反应30 50min,85反应5min将RNA反转录成cDNA。1.2.3JEV非结构蛋白的克隆与鉴定以1.2.2中得到的cDNA为模板，采用聚合酶链式反应利用1.2.1表中设计的引物将各个非结构蛋白的基因扩增出来。PCR反应体系（50 L)如下：cDNA 2L；上游引物1L；下游引物1 L;2Phanta FlashMasterMix25L;ddH,O21L。PC R反应条件如下：9 8，预变性30 s；9 8 变性10 s，58 退火5s，7 2 延伸15s；共30 个循环，7 2 延伸1min，完成反应。将上述反应产物进行琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像系统下观察结果，将判断大小正确的PCR产物进行凝胶回收，将回收产物与克隆载体pEASY-zero在37 下连接30 min，所得质粒称为zero-NSl、z e r o-NS2 a、z e r o-NS3、z e r o-NS5。将上述重组质粒转化至trans-T1感受态细胞中，挑取阳性克隆，扩大培养后提取质粒测序鉴定，将质粒送至擎科生物技术有限公司测序。1.2.4JEV非结构蛋白表达载体的构建将上述测序正确的质粒和pEGFP-N1质粒分别用BamH1和Xhol进行双酶切,胶回收正确大小的片段，将两者进行T4连接，2 5条件下反应2 0 min。将获得的重组质粒转化至 trans-T1 感受态中，进行过夜培养，挑取菌落进行测序鉴定，经测序鉴定正确的菌落进行质粒小提，获得重组表达质粒，分别命名为pEGFP-N1-NS1、p EG FP-N1-NS2 a、p EG FP-N1-NS3、p EG FP-N1-NS5。1.2.5JEV非结构蛋白的表达将上述测序正确的的pEGFP-N1-NS1、p EG FP-N1-NS2 a、p EG FP-N1-NS3、p EG FP-N1-NS5 进行去内毒素大提，将生长状态良好Vero细胞接种到六孔板细胞培养板中，每孔接种410 5个细胞，过夜培养，待细胞接种到8 0%到9 0%，准备进行转染，转染前1h更换完全培养液。设置以下转染组pEGFP-N1-NS1，p EG-FP-N1-NS2a，p EG FP-N1-NS3，p EG FP-N1-NS5,pEGFP-N1及空白对照组，转染2 4h后，使用荧光显微镜观察各蛋白的表达情况。1.2.6免疫共沉淀将生长状态良好的Vero细胞接种到六孔板细胞培养板中，每孔接种410 5个39细胞，过夜培养，待细胞接种到8 0%到90%，准备转染，同样转染前需更换完全培养液。设置以下转染组 pEGFP-N1-NS1和 pCMV-Myc-hnRNP K、p EG-FP-N1-NS2a 和 pCMV-Myc-hnRNP K、p EG FP-N1-NS3和pCMV-Myc-hnRNP K、p EG FP-N1-NS5和 pCMV-Myc-hnRNP K。转染2 4h后，收细胞总蛋白，向10 0 L的蛋白样品中加人40 L预处理好的proteinA/Gplusbeads与无关血清，于 4,旋转摇床孵育14 h，除去非特异性的杂蛋白，4，30 0 0 r/min，离心3min，留上清。向12 0 _ L预处理好的proteinA/Gplusbeads加入5gGFP抗体，于4旋转摇床孵育4h，使beads和抗体充分偶联，于430 0 0 r/min,离心5min,重复3次。将除杂后的蛋白加人到beads和抗体偶联复合物中，与4,旋转摇床孵育6 8 h，使Beads-抗体-蛋白充分偶联，430 0 0r/min,离心3min，弃去上清。取出离心管43000r/min，离心5min，弃去上清，向beads复合物中加人裂解液，盖上盖子颠倒混匀，于430 0 0r/min,离心5 min洗35次，弃上清,最后一次离心将上清吸干。加 SDS-PAGE Sample LoadingBuffer(5X），金属浴煮沸10 min，瞬时离心，小心吸出上清，将上清转到新的离心管中，一8 0 保存。进行Western-blot检测，将细胞裂解后的蛋白样品与免疫共沉淀之后的样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行转膜，30 0 mA转印2 h，标记膜的正面，将膜置于5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭12 h，封闭结束后,用PBST将膜清洗 3次，每次5min，洗完后将蛋白面朝下孵育抗体，分别用GFP抗体和 hnRNPK抗体4孵育过夜。抗体孵育完毕后，将膜用PBST洗6 遍每次5min，洗完后将蛋白面朝下孵育二抗，用PBST将山羊抗小鼠抗体稀释至适宜浓度，室温摇床上孵育2 h，孵育后将膜用PBST洗3次，每次10 min，按照ECL显色试剂盒说明书进行显色，保存图像，进行结果分析。1.2.7JEV全基因系统进化分析将实验室保存的病毒基因序列与GenBank 中的乙型脑炎病毒(表2)进行序列比对，进行进化分析，在GenBank中选取不同时间不同地区的JEV序列进行，用Megal1软件构建进化树。2结果2.1JJEV非结构蛋白基因的扩增结果如图1所示，成功扩增了NS1、NS2 a、NS3、NS540表2 进化分析中所引用的乙型脑炎病毒株详细信息Tab.2Details of Japanese encephalitis virus strains cited inthe evolutionaryanalysis基因库编号名称Gene bankNamenumberMN639770JEV1805MKX779521JEV/SC/2016-1MK585066SA 14-14-2KU821122SA14MH7531283SH1MF002373FC792JN864064YUNNAN0901OP588746Beijing/2020-1MH753126N28MZ923735WHJEV/SW/GZ/KF29791609/2004JEV/mosque/MH385014YN/201618000bp3 000 bp1 000bp:500bp注：1.DNA分子量标准；2.NS1;3.NS2a;4.NS3;5.NS5图1JEV非结构蛋白基因的扩增Note:1.DNA Marker;2.NSl;3.NS2a;4.NS3;5.NS5Fig.1Amplification of JEV non-structural protein geneEGFP北京农学院学报基因，大小分别为10 56 bp、6 8 1b p、18 57 b p、2 7 15bp,与预期大小一致。2.2JEV非结构蛋白表达载体的构建基因库编号名称Gene bankNamenumberMH753130SH15MH753131SH19MH753127SD12KY650727ZJ10-10OK423757JEV-SC-2020-1MT134112NX1889MT560941GZDJ1609seal/China/MH165313anheal/2017MH753129SH7MH753133SH2OM572545 LN1814MK558811ZJ/52/1423Bright field第39卷根据图2 琼脂糖凝胶结果显示，pEGFP-N1和各非结构蛋白质粒酶切成功。128 000 bp3 000 bp1 000bp注：1.DNA分子量标准；2.pEGFP-N1载体酶切；3.NS1双酶切；4.NS2双酶切；5.NS3双酶切；6.NS5双酶切453图2 JEV非结构蛋白质粒酶切图Note:1.DNA Marker;2.pEGFP-N1 vector double diges-tion;3.NS1 double digestion;4.NS2 double digestion;5.NS3doubledigestion;6.NS5doubledigestionFig.2 Enzyme digestion diagram of JEV non-structuralplasmid2.3JEV非结构蛋白的表达由图3可见，pEGFP-NS1,pEGFP-NS2a,pEG-FP-NS3,pEGFP-NS5,pEGFP-N1质粒在转染2 4h后，在荧光显微镜下观察到绿色荧光，证明GFP标签融合蛋白正常表达，可见pEGFP-NS1，p EG FP-NS2a,pEGFP-NS3，p EG FP-NS5在细胞上表达正常，质粒表达成功。Bright field456EGFPmockpEGPF-N1-NS2apEGPF-N1-NS3pEGPF-N1pEGPF-N1-NS1pEGPF-N1-NS5图3转染非结构蛋白质粒的细胞荧光Fig.3 Cellular fluorescence of transfected non-structural protein particles2024年第1期郝悦等：乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNPK的相互作用2.4JEV非结构蛋白与hnRNPK外源性免疫共IP:GFP沉淀pEGFP-N1-NS1WB:-GFP如图4可见，共转染非结构蛋白和hnRNPKWB:-hnRNPK蛋白的质粒，用GFP抗体进行免疫共沉淀，分别用pEGFP-N1-NS2aGFP抗体和hnRNPK抗体做一抗，在Vero全细胞WB:-GFP裂解液中可以检测到各非结构蛋白和 hnRNP K蛋WB:-hnRNPK白，在IP组能够检测到各非结构蛋白的表达，但只pEGFP-N1-NS3在NS1组检测到hnRNPK蛋白的表达，说明NS1WB:-GFP蛋白与 hnRNP K存在相互作用且 NS2a、NS3和WB:-hnRNPKNS5 与 hnRNP K不存在相互作用。pEGFP-N1-NS52.5JEV基因进化分析WB:-GFP由图5可见，实验室保存的JEV毒株与WB:-hnRNP KBeijing/2020-1亲缘关系最近。图4JEV非结构蛋白与hnRNPK的外源性相互作用Fig.4 Exogenous interactions of JEV non-structural pro-teins with hnRNPK94/MN63970.apanesencephaltis vru solate EV1805 compltegenomeKX779521.1 Japanese encephalitis virus isolate JEV/SC/2016-1 complete genome100MK585066.1 Japanese encephalitis virus strain SA14-14-2 complete genome99MF002373.1 Japanese encephalitis virus isolate FC792 complete genome9965-JN884084.1 Japanese encephalitis virus strain YUNNAN0901 complete genomeKU821122.1 Japanese encephalitis virus strain SA14 polyprotein mRNA complete cds61MH753128.1 Japanese encephalitis virus strain SHI complete genome100 OP588746.1 Japanese encephalitis virus isolate Being/2020-1 complete genomeJEV.dna(10 977 bp)92100MH753126.1 Japanese encephalitis virus strain N28 complete genome93MH753130.1 Japanese encephalitis virus strain SH15 complete genome10064 MH7531311 Japanese encephalitis virus strain SH19 complete genomeMZ923735.1 Japanese encephalitis virus isolate WH complete genomeKF297916.1 Japanese encephalitis virus isolate JEV/SW/GZ/09/2004 complete genomeMH385014.1 Japanese encephalitis virus strain JEV/mosgYN/2018 complete genome97rMH753127.1 Japanese encephalitis virus strain SD12 complete genome100L MH753129.1 Japanese encephalitis virus strain SH7 compiete genomeMH753133.1 Japanese encephaltis virus strain SH2 compiete genome100KY650727.1 Japanese encephalitis virus isolate ZJ10-10 complete genomeOK423757.1 Japanese encephalitis virus strain JEV-SC2020-complete genome9899OM572545.1 Japanese encephalitis virus isolate LN1814 polyprotein gene complete cds90MT134112.1 Japanese encephalitis virus strain NX1889 corplete genome64MK558811.1 Japanese encephalitis virus strain ZJ/52/14 complete genome49MT560941.1 Japanese encephalitis virus isolate GZDJ1609 complete genome86-MH165313.1 Japanese encephalitis virus strain seal/china/anheal2017 cormplete genome0.01图5根据JEV全基因序列构建的进化树Fig.5 Evolutionary tree constructed from JEV whole gene sequence3 讨 论日本脑炎是一种严重的人畜共患急性传染病，危害人类健康，在亚洲地区分布广泛，目前针对JEV的感染缺乏有效的治疗药物12.13，该病主要依靠接种疫苗和防蚊灭蚊等预防手段。该试验通过构建非结构蛋白的表达质粒，利用外源性免疫沉淀试验说明了JEV的 NS1蛋白与hnRNPK蛋白存在相互作用，为JEV非结构蛋白的研究提供了思路。在病毒感染中hnRNPK也发挥关键作用，其可以通过与病毒蛋白直接或间接发生相互作用，参与不同病毒的生命活动周期，对病毒产生促进或抑41细胞裂解液+细胞裂解液+细胞裂解液+细胞裂解液+一制的作用。例如，在丙型肝炎病毒的研究中，hnRNPK能够与病毒的核心蛋白和病毒正链RNA共定位且能发生相互作用，从而减少了丙型肝炎病毒成熟粒子的产生19。在乙型肝炎病毒的研究中，hnRNP K与病毒基因组中的增强子发生相互作用，从而促进病毒表面基因的转录2 0 。在人类免疫缺陷病毒的研究中,hnRNP K可与 Nef 蛋白结合,增强病毒的转录2 1。在水疱性口炎病毒的研究中，hnRNP K 可以抑制促调亡蛋白 Bcl-xs 和Bik，促进感染病毒的细胞存活，从而提高了病毒在细胞中的存活率2 2 。HnRNP K在不同的亚细胞结构中能与不同的蛋白相互作用，从而参与多种细胞信号通路的调控，在生物体内发挥多种功能。+IP:GFP+IP:GFP+IP:GFP+-NS1-hnRNPK-NS2a-hnRNP K-NS3-hnRNPK-NS5-hnRNP K42参考文献：1陈间峰，汤德元，杨志刚，等.日本乙型脑炎病毒感染宿主后引起相关信号通路变化的研究进展中国兽医学报，2023,43(1):199-203.2MCMINN PETER C.The molecular basis of virulence of theencephalitogenic flavivirusesJJ.Journal of General Virology,1997,78(1):2711-2722.3TOBISS E ERIANGER,SVENJA WEISS,KEISER JENNI-FER,et al.Past,present and future of Japanese encephalitisJJ.Emerging Infectious Diseases,2009,15(1):1-7.4OKAMOTOT,SUZUKI T,KUSAKABE S et al.Regulationof apoptosis during flavivirus infectionJ.Viruses,2017,9(243):1-12.5ROTHAN H A,KUMAR M.Role of endoplasmic reticulum-Associated proteins in flavivirus replication and assemblycomplexesJJ.Pathogens,2019,8(3):148-158.6 LINDENBACH B D,RICE C M.Trans-complementation ofyellow fever virus NSl reveals a role in early RNA replicationJ.V ir o l,19 9 7,7 1:9 6 0 8-9 6 17.7 LEUNGJ Y,PIJLMAN G P,KONDRATIEVA N,et al.Roleof nonstructural protein NS2A in flavivirus assemblyLJJ.Vir-ol,2008,82:4731-4741.8SAMPATH A,PADMANABHAN R.Molecular targets forflavivirus drug discoveryJ.Antivir Res,2009,81:6-159 KLAITONG P,SMITH D R.Roles of non-structural protein4A in flavivirus infectionJ.Viruses,2021,13:2077-2096.10BHATNAGAR P,BAJPAI P,SHRINET J,et al.Predictionof human protein interactome of dengue virus non-structuralprotein 5(NS5)and its downstream immunological implica-tionsLJJ.Biotech,202313(3):180-193.11梁小娟，徐海霞，李瑞，等.猪hnRNPK蛋白与酪氨酸蛋白激酶c-Src的互作分析J.畜牧兽医学报，2 0 18，49（2）：243-252.12CAMPBELL G L,HILLS S L,FISCHER M,et al.Estimatedglobal incidence of Japanese encephalitis:a systematic review北京农学院学报JJ.Bull World Health Organ,2011,89(10):766-774.13郭纯.免疫共沉淀技术的研究进展J.中医药导报，2 0 0 7，13(12):86-89.14吴萌，李，陈铭.两种实验技术在蛋白质-蛋白质相互作用检测中的应用J.生命的化学，2 0 2 1，41（2）：353-36 0.15BARBORO P,FERRARI N,BALBI C.Emerging roles ofheterogeneous nuclear ribonucleoprotein K（h n RNP K)i n-cancer progressionJJ.Cancer Lett,2014,352(2):152-159.16PUENTE L G,VOISIN S,LEE R E C,et al.Reconstructingthe regulatory kinase pathways of mygenesis from phos-phopeptide data EJJ.Mol Cell Proteomics,2006,5（12):2244-2251.17GONNET F,BOUAZZA B,MILLOT G A,et al.Proteome a-nalysis of differentiating human myoblasts by dialysis-assisted two-dimensional gel electrophoresis J.Prtemics,2008,8(2):264-278.182XU Y J,QIAN H,FENG X T,et al.Differential proteomeand transcriptome analysis of porcine skeletal muscle duringdevelopmentJJ.Protemics,2012,75(7):2093-2108.19HAMMAM O,MAGDY M,ANAS A,et al.Expression ofhnRNP K&claudin-4 in HCV-induced early HCC andadjacent liver tissueLJJ.Open Access Maced J Med Sci,2017,5(5);595-602.20BROERINGR,TRIPPLER M,WERNER M,et al.Hepaticexpression of proteasome subunit alpha type-6 is upregulatedduring viral hepatitis and putatively regulates the expressionof ISG15 ubiquitin like modifier,a proviral host gene in hepa-titis C virus infectionJ.J Viral Hepat,2016,23（5):375-386.21LEE J H,WITTKI S,BRAU T,et al.HIV Nef,paxillin,andPakl/2 regulate activation and secretion of TACE/ADAM10proteasesJJ.Mol Cell,2013,49(4):668-679.22PETTIT KNELLER E L,CONNOR J H.LYLES D S.hnRNPs relocalize to the cytoplasm following infection withvesicular stomatitis virusLJJ.J Virol,2009,83(2):770-780.第39卷