基于网络药理学及实验验证探讨胃宁颗粒治疗胃癌的物质基础及作用机制.pdf

Pharmacy Information 药物药物资讯资讯,2024,13(2),56-67 Published Online March 2024 in Hans.https:/www.hanspub.org/journal/pi https:/doi.org/10.12677/pi.2024.132008 文章引用文章引用:赵桂玉,秦艺文,戴文娟,陈广玲,吴黎川,韦金锐.基于网络药理学及实验验证探讨胃宁颗粒治疗胃癌的物质基础及作用机制J.药物资讯,2024,13(2):56-67.DOI:10.12677/pi.2024.132008 基于网络药理学及实验验证探讨胃宁颗粒基于网络药理学及实验验证探讨胃宁颗粒 治疗胃癌的物质基础及作用机制治疗胃癌的物质基础及作用机制 赵桂玉赵桂玉1*，秦艺文，秦艺文1，戴文娟，戴文娟1，陈广玲，陈广玲1，吴黎川，吴黎川1，韦金锐，韦金锐2#1广西大学医学院，广西 南宁 2广西中医药大学，广西中医药科学实验中心，广西 南宁 收稿日期：2024年2月9日；录用日期：2024年3月8日；发布日期：2024年3月15日 摘摘 要要 目的探究胃宁颗粒治疗胃癌的物质基础及作用机制。方法利用目的探究胃宁颗粒治疗胃癌的物质基础及作用机制。方法利用CCK-8及及transwell实验检测胃宁颗粒对胃实验检测胃宁颗粒对胃癌细胞增殖及迁移的影响；通过液相色谱癌细胞增殖及迁移的影响；通过液相色谱质谱联用及蛋白质组技术分别获得胃宁颗粒活性成分及差异质谱联用及蛋白质组技术分别获得胃宁颗粒活性成分及差异表达蛋白；通过网络药理学及表达蛋白；通过网络药理学及Cytoscape 3.9.1软件构建胃宁颗粒活性成分软件构建胃宁颗粒活性成分靶点靶点胃癌网络；利用胃癌网络；利用GO/KEGG开展富集分析；利用分子对接阐明关键核心靶点与活性成分的相互作用。结果共筛选出胃宁颗开展富集分析；利用分子对接阐明关键核心靶点与活性成分的相互作用。结果共筛选出胃宁颗粒治疗胃癌有效成分粒治疗胃癌有效成分23个，作用靶点个，作用靶点19个；个；PI3K-Akt及凋亡通路可能是胃宁颗粒治疗胃癌的主要作用及凋亡通路可能是胃宁颗粒治疗胃癌的主要作用通路；通路；VEGFA、BCL2L1及及CDK4可能是胃宁颗粒治疗胃癌的关键靶点。结论刺芒柄花素、槲皮素、莪术可能是胃宁颗粒治疗胃癌的关键靶点。结论刺芒柄花素、槲皮素、莪术二酮可能是胃宁颗粒治疗胃癌的物质基础，与调控二酮可能是胃宁颗粒治疗胃癌的物质基础，与调控VEGFA、BCL2L1及及CDK4信号通路有关。信号通路有关。关键词关键词 胃宁颗粒，胃癌，网络药理学，分子对接，作用机制胃宁颗粒，胃癌，网络药理学，分子对接，作用机制 Exploring the Material Basis and Mechanism of Weining Granules against Gastric Cancer Based on Network Pharmacology and Experiment Validation Guiyu Zhao1*,Yiwen Qin1,Wenjuan Dai1,Guangling Chen1,Lichuan Wu1,Jinrui Wei2#1School of Medicine,Guangxi University,Nanning Guangxi 2Guangxi Scientific Research Center of Traditional Chinese Medicine,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning Guangxi *第一作者。#通讯作者。赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 57 药物资讯 Received:Feb.9th,2024;accepted:Mar.8th,2024;published:Mar.15th,2024 Abstract Objective to explore the material basis and mechanism of Weining Granules in the treatment of gastric cancer.Methods cell viability and migration were detected via CCK-8 and transwell assays.The active compounds and differentially expressed proteins of WNG were obtained by liquid chromatography-mass spectrometry and proteomics techniques,respectively.The active ingre-dient-target-gastric cancer network was constructed by using Cytoscape 3.9.1 software.GO/KEGG Enrichment analysis was performed to predict the signaling pathway.Key core targets were re-vealed through PPI(Protein protein interaction).The interactions between key core targets and active ingredients were explored by molecular docking.Results A total of 23 effective compounds and 19 targets of WNG were identified against gastric cancer.KEGG pathway analysis found that PI3K-Akt and apoptosis pathway may be the main therapeutic pathways of WNG against gastric cancer.The PPI action network and bioinformatics analysis reveal that VEGFA,BCL2L1,and CDK4 are key therapeutic targets for gastric cancer.Conclusion formononetin,quercetin,and curdione may be the main material basis of WNG in the treatment of gastric cancer,which is related to the regulation of VEGFA,BCL2L1,and CDK4 signaling pathways.Keywords Weining Granules,Gastric Cancer,Network Pharmacology,Molecular Docking,Mechanism Copyright 2024 by author(s)and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License(CC BY 4.0).http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/1.引言引言 胃癌是常见的癌症之一。世界卫生组织数据显示，2020 年全球新发胃癌病例 108.9 万例，占全球新发癌症病例的 5.6%；死亡病例 76.9 万例，占死亡病例的 7.7%。中国胃癌病例 47.8 万例，死亡 37.4 万例，分别占全球胃癌病例和死亡人数的 43.94%和 48.62%1。虽然 20042020 年中国胃癌标化死亡率呈下降趋势，但由于老龄化趋势严峻，胃癌在中国的发病率、致死率仍然较高2。癌症的早发现、早诊断、早治疗是降低死亡风险和延长生存期的主要策略，但胃癌早期病例仅占 10%20%3，大部分患者确诊时处于中晚期，整体预后较差。胃癌早期多无明显特殊症状，起病较隐匿，临床上通常采用保守的全身综合治疗方法，如放疗、化疗、靶向药物治疗以及生物免疫治疗。然而，放化疗副作用较大，靶向药物及免疫治疗适应症有限、费用昂贵4 5 6。因此，急需开发新的胃癌治疗药物。中医药作为我国国粹，因其具有“高效、低毒、多靶点、低成本”等优势，被广泛应用于各种肿瘤的治疗7，如槐耳颗粒8、斑蝥胶囊9等。中医药通过抑制细胞增殖、细胞侵袭与转移、血管生成，诱导细胞凋亡及自噬，提升肿瘤患者的免疫力及增敏化疗药物的敏感性而发挥临床抗癌疗效10。大量的临床资料表明，化疗配合中药及其有效活性成分治疗肿瘤比单纯化疗具有更好的疗效和更低的不良反应11 12 13。胃宁颗粒(Weining Granules,WNG)作为中药复方制剂，主要由黄芪、莪术、茯苓、枸杞等药材组成。临床数据表明胃宁颗粒在胃癌治疗中表现突出，在改善胃癌患者临床症状、延长生存期、以及减轻化疗后不良反应等方面，具有确切的临床疗效14，然而其治疗胃癌的物质基础及作用机制仍未完全阐明。Open AccessOpen Access赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 58 药物资讯 网络药理学的概念由英国安德鲁霍普金斯教授于 2007 年首次提出15。该方法结合药理学、分子生物学、医学、生物信息学以及统计学探讨药物对疾病的作用机制16。网络药理学因其多靶点、多通路、可视化等特点已被广泛地应用于预测药物成分及探讨疾病的潜在作用机制17。例如，李媛媛等人运用网络药理学并结合实验验证探讨了江南卷柏治疗喉癌的作用机理18。Fan 等通过网络药理学解析了左金胶囊抑制结肠癌的作用机制19。本研究基于网络药理学、蛋白互作分析、富集分析、差异表达分析、生存分析等生物信息学方法，并结合液相色谱质谱联用及蛋白质组技术揭示胃宁颗粒治疗胃癌的有效成分及作用机制，绘制“胃宁颗粒成分靶点通路胃癌”互作网络图，进一步通过分子对接揭示胃宁颗粒有效成分对靶点的作用。2.方法方法 2.1.胃宁颗粒主要活性成分的筛选及靶点预测胃宁颗粒主要活性成分的筛选及靶点预测 本课题组前期通过色谱质谱联用技术获得胃宁颗粒主要活性成分 23 个20(表 1)。随后，将得到的活性成分名称输入 Pubchem 数据库(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索，获得该化合物的 2D 结构，将 2D 结构或 SMILES 结构式导入 Swiss Target Prediction 数据库(http:/www.swisstargetprediction.ch/)，以置信度 probability 0 为筛选阈值预测化合物潜在靶点。2.2.胃宁颗粒调控的差异表达蛋白胃宁颗粒调控的差异表达蛋白 本论文使用的胃癌细胞 SGC-7901 购自于中国科学院细胞库，并培养在含 10%胎牛血清及 100 U/ml的青霉素及链霉素的 DMEM 培养基中。使用浓度为 0.1 g/ml 的胃宁颗粒处理 SGC-7901 细胞 48 小时，获取细胞总蛋白后采用 TMT 标记定量蛋白质组学揭示胃宁颗粒导致的蛋白表达谱变化。随后，以表达倍数|Fold Change|1.2，P 0.05 为筛选标准获得胃宁颗粒调控的差异表达蛋白。2.3.交集靶点的确定和富集分析交集靶点的确定和富集分析 首先，将化合物预测靶点和差异表达蛋白导入 Venny 2.1.0(http:/b.csic.es/tools/venny/)绘制韦恩图，筛选出交集靶点蛋白。其次，将交集靶点蛋白导入 Metascape 平台(https:/metascape.org/gp/index.html)，以 P 0 为阈值筛选得到 437 个成分相关靶点，其中甜菜碱(Betaine)无符合阈值条件的相关靶点，故胃宁颗粒中实含 22 个有效成分。Table 1.The main active compounds in WNG 表表 1.胃宁颗粒中的主要活性成分 编号 化合物 分子式 相对分子质量 1 柠檬酸 C6H8O7 192.12 2 甜菜碱 C5H11NO2 117.15 3 毛蕊异黄酮 C16H12O5 284.26 4 毛蕊异黄酮苷 C22H22O10 446.40 5 薯蓣皂 c 素 C27H42O3 414.62 6 刺芒柄花 C16H12O4 268.27 7 莪术醇 C15H22O2 234.33 8 茯苓酸 B C30H44O5 484.68 9 芒柄花苷 C22H22O9 430.41 10 莪术二酮 C15H24O2 236.35 11 腺苷 C10H13N5O4 267.24 12 黄芪皂苷 I C45H72O16 869.04 13 秦皮甲 C15H16O9 340.28 14 黄芪异黄烷苷 C23H28O10 464.47 15 松脂素单甲基醚-D-葡萄糖苷(松脂醇-4-O-BETA-D-吡喃葡萄糖苷)C26H32O11 520.53 16 双羟香豆 C19H12O6 336.29 17 黄芪皂苷 C43H70O15 827.01 18 羟基番茄胺 C27H45NO3 431.65 19 重楼皂苷 C51H84O22 1049.20 20 薯蓣皂苷 C45H72O16 869.04 21 黄芪甲苷 C41H68O14 784.97 22 槲皮素 C15H10O7 302.24 23 重楼皂苷 VI C39H62O13 738.90 3.3.胃宁颗粒处理下胃癌细胞胃宁颗粒处理下胃癌细胞 SGC-7901 蛋白表达谱变化蛋白表达谱变化 根据本课题组前期研究20，以|Fold Change|1.2，P 0.05 为标准，获得 619 个胃宁颗粒处理下胃癌细胞差异表达蛋白(图 2)。赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 61 药物资讯 Figure 2.Volcano plot of differentially expressed proteins induced by WNG 图图 2.胃宁颗粒诱导的胃癌差异表达蛋白火山图 3.4.交集靶点的确定及交集靶点的确定及 GO/KEGG 分析分析 Figure 3.Venn diagram of drug components and disease intersection targets 图图 3.药物成分与疾病交集靶点的韦恩图 Figure 4.GO enrichment analysis 图图 4.GO 富集分析 赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 62 药物资讯 Figure 5.KEGG pathway enrichment analysis 图图 5.KEGG 通路富集分析 将预测的成分靶点与差异表达蛋白取交集，共得到 19 个交集靶点(图 3)。将 19 个交集靶点导入Metascape 数据库中进行 GO 分析和 KEGG 富集分析(P 0.104，closeness 0.218，degree 2.22 为阈值筛选出 3 个核心成分，分别是：槲皮素(Quercetin)、莪术二酮(Curdione)、刺芒柄花素(Formononetin)。Figure 6.WNG-component-target-pathway-gastric cancer network 图图 6.胃宁颗粒成分靶点通路胃癌网络图 赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 63 药物资讯 3.6.核心靶点的筛选核心靶点的筛选 将交集靶点蛋白输入 STRING 数据库，构建蛋白蛋白互作(PPI)网络并利用 Cytoscape 3.9.1 软件得到可视化的 PPI 网络(图 7)。图中共有 17 个节点，30 条边，网络中节点的颜色越深、形状越大，就代表该靶点的度值越大，在网络中的重要性越高。利用 cytoHubba 插件计算拓扑参数，以介数中心性、接近中心性、度值三类参数同时大于平均值为阈值，筛选出本次研究的核心靶点(表 2)。度值排名前三的核心靶点是：VEGFA、BCL2L1、CDK4。Figure 7.PPI network of the intersection targets 图图 7.交集靶点 PPI 网络 Table 2.Topological analysis results of protein targets in PPI network 表表 2.PPI 网络蛋白靶点拓扑分析结果 编号 靶点 度值 介数中心性 接近中心性 1 VEGFA 8.0 60.066666 0.23188406 2 BCL2L1 8.0 51.933334 0.23188406 3 CDK4 7.0 25.066668 0.22535211 4 BIRC5 5.0 8.533334 0.21333334 5 TOP2A 4.0 1.6666666 0.2 6 MCL1 4.0 2.0 0.21621622 7 TOP1 4.0 6.733333 0.21621622 8 TK1 3.0 0.0 0.19753087 9 HMOX1 3.0 24.0 0.21052632 10 PLG 2.0 0.0 0.2 11 F2 2.0 0.0 0.2 12 FDFT1 2.0 0.0 0.06666667 13 SOAT1 2.0 0.0 0.06666667 14 CYP51A1 2.0 0.0 0.06666667 15 NR3C1 2.0 0.0 0.20512821 16 EPHX1 1.0 0.0 0.18181819 17 PSEN2 1.0 0.0 0.19753087 赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 64 药物资讯 3.7.核心靶点在胃癌中的表达、预后及核心靶点在胃癌中的表达、预后及 ROC 分析分析 进一步的，我们通过生物信息学评估了排名前 3 的核心靶点在胃癌发生中的潜在作用。首先，通过差异表达分析发现，与癌旁组织相比，VEGFA、BCL2L1、CDK4 皆显著高表达于胃癌组织(图 8(A)；其高表达与胃癌患者预后不良显著正相关(图 8(B)；ROC 分析结果提示这三个核心基因是胃癌良好的临床预测指标(图 8(C)。Figure 8.Expression and prognosis of key targets in GC.(A)DEGs analysis;(B)ROC analysis;(C)Prognosis analysis 图图 8.核心基因在胃癌中的表达及预后分析。(A)差异表达分析；(B)ROC 分析；(C)预后分析 3.8.分子对接分子对接 将胃宁颗粒核心成分(莪术二酮、刺芒柄花素、槲皮素)与核心靶点(VEGFA、BCL2L1、CDK4)做分子对接。结果显示：VEGFA、BCL2L1、CDK4 分别与莪术二酮、刺芒柄花素、槲皮素对接活性最好(表3、图 9)。Table 3.The molecular docking score of core targets and core components 表表 3.核心靶点与核心成分的分子对接分数 核心靶点 核心成分 score Curdione 7.43 VEGFA Formononetin 5.53 Quercetin 4.84 Formononetin 7.74 BCL2L1 Quercetin 6.11 Curdione 5.73 Curdione 6.62 赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 65 药物资讯 续表 CDK4 Quercetin 6.05 Formononetin 5.1 Figure 9.The molecular docking between core targets and compounds 图图 9.核心蛋白与核心成分的分子对接 4.讨论讨论 胃宁颗粒是全国名老中医蓝青强教授基于多年临床经验研制而成的中药复方，对胃癌有很好的临床治疗效果14。相关研究结果表明，胃宁颗粒能抑制胃癌细胞的增殖，诱导胃癌细胞凋亡20。然而，目前胃宁颗粒治疗胃癌的药效基础及作用机制仍未阐明。本研究基于整合生物信息学(网络药理学、分子对接、差异表达分析、预后分析及 ROC 分析)并结合实验(液相色谱质谱联用及蛋白质组学)系统探讨了胃宁颗粒治疗胃癌的有效活性成分、作用靶点及信号通路。结果显示，胃宁颗粒抗胃癌主要活性成分 23 个，作用于 19 个胃癌相关靶点。作用靶点主要富集在 PI3K-Akt 信号通路、癌症途径通路、细胞凋亡通路、类固醇生物合成信号通路及化学致癌通路等相关通路。分子对接结果提示胃宁颗粒治疗胃癌的核心成分是刺芒柄花素、槲皮素、莪术二酮，核心靶点则为 VEGFA、BCL2L1 及 CDK4。网络药理学基于其“多成分多靶点多通路”的原理被广泛运用于中药复方药效的解析。目前，在大部分网络药理学的相关研究中，科研工作者选取的化合物分子(活性成分)大部分源自文献报道和相关网络数据库，如 TCMSP、TCMID、GeneCards 及 OMIM 等，并未进行真正的实验研究(分离提取及鉴定)。由于提取工艺和药物/植物资源产地不同网络数据库中已报道成分未必在该种药用提取物中存在，这会导致构建的网络及预测的作用机制不够准确。在本研究中，我们通过液相色谱质谱联用实验确认胃宁颗粒的主要成分，通过蛋白质组学获得胃宁颗粒导致的差异表达蛋白作为作用靶点。相较于传统网络药理学，我们的结果更为真实、可靠。本研究发现的三个核心靶点VEGFA、BCL2L1及CDK4在胃癌的发生发展中扮演了至关重要的角色。赵桂玉 等 DOI:10.12677/pi.2024.132008 66 药物资讯 血管生成是肿瘤增殖及转移最重要的环节之一，调控血管生成的基因往往是肿瘤治疗的潜在靶点21。研究报道显示 VEGFA 可以诱导肿瘤血管生成，从而促进胃癌的生长与转移22。目前，已有包括Ramucirumab 23、Apatinib 24在内的多种 VEGFA 靶向治疗胃癌药物。BCL2L1 是 BCL-2 家族的抗凋亡成员，在胃癌组织中高表达，下调 BCL2L1 抑制胃癌细胞增殖25。CDK4 参与细胞周期调控，其高表达是胃癌细胞异常增殖的重要原因之一26。在本研究中，我们发现三个核心成分莪术二酮(Curdione)、刺芒柄花素(Formononetin)及槲皮素(Quercetin)与以上三个核心靶点有很好的对接活性。已有研究结果表明刺芒柄花素及槲皮素能下调 VEGFA 的表达，抑制血管形成27 28。槲皮素能通过下调 BCL2L1 诱导胃癌细胞凋亡29。槲皮素及刺芒柄花素能下调 CDK4 的表达诱导细胞周期阻滞30 31。我们的研究一方面验证了前人已发表的结果，另一方面发现了潜在的蛋白抑制物。PI3K/Akt 信号通路是各种类型癌症的主要信号通路，通过影响细胞存活、转移和代谢从而调控癌症的发生与发展32。例如，PI3K/Akt 的持续活化促进非小细胞肺癌的发生及发展33。异常激活的 PI3K/Akt通路可以诱导 EMT 进而促进胃癌转移34。PI3K/Akt 通路的异常活化是肝癌转移的主要因素35。TNF-可通过上调 PI3K/Akt 信号通路中关键因子，增强口腔鳞癌细胞侵袭转化能力36。因此，PI3K/AKT 通路被认为是癌症最重要的靶点之一。5.结论结论 综上所述，本研究基于网络药理学及富集分析发现胃宁颗粒有效成分可能通过抑制 PI3K/AKT 通路活性从而降低胃癌细胞活性及侵袭。PI3K/AKT 通路可能是胃宁颗粒抗胃癌主要作用机制。基金项目基金项目 广西大学大学生创新创业训练计划项目(S202210593280)。参考文献参考文献 1 Sung,H.,Ferlay,J.,Siegel,R.L.,et al.(2021)Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries.CA:A Cancer Journal for Clinicians,71,209-249.https:/doi.org/10.3322/caac.21660 2 郭浩阳,陈玉娟,汪伟,等.2004-2020 年中国胃癌死亡趋势分析J.长治医学院学报,2022,36(6):418-422.3 中华医学会肿瘤学分会,中华医学会杂志社.中华医学会胃癌临床诊疗指南(2021 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