基于网络药理学探明八宝丹治疗原发性肝癌的潜在机制研究.pdf

论著 基于网络药理学探明八宝丹治疗原发性肝癌的潜在机制研究朱鑫宇1，白浩然2，赵娜萍1，戚大川2，卫立辛3，张黎1（1.海军军医大学第一附属医院临床研究中心,上海200433；2.上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科，上海 200032；3.国家肝癌科学中心,上海 201805）摘要目的基于网络药理学探讨八宝丹对原发性肝癌（HCC）影响的潜在机制。方法首先利用二乙基亚硝胺诱导的原发性 HCC 大模型，观察八宝丹对 HCC 的影响；然后利用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）检测八宝丹中的有效成分，再在 Swiss Target Prediction 数据库等预测八宝丹有效成分的潜在作用靶点。运用 GeneCards、OMIM 和 TherapeuticTarget Database 筛选 HCC 对应靶点，取交集后获得八宝丹与 HCC 的共同靶点。使用 Cytoscape 软件和 STRING 数据库绘制蛋白与蛋白间互作网络，筛选出八宝丹调控 HCC 的关键分子。利用 DAVID 数据库对有效作用靶点进行 GO 及 KEGG 富集分析。最后在 TCGA 数据库验证关键分子与 HCC 患者的临床相关性。结果八宝丹可延缓 HCC 大鼠肿瘤进展。UPLC-MS 检测出八宝丹中化学成分 851 个，主要活性成分 9 个，作用靶点 285 个；筛选出 HCC 靶点 637 个，八宝丹调控 HCC 的靶点 16 个。GO 富集分析显示 802 个生物过程、11 个细胞组成、43 个分子功能，KEGG 通路共 90 条。TCGA 相关性分析发现 3 个关键分子与 HCC 患者生存期相关。结论通过 HCC 大鼠模型发现，八宝丹可显著延长 HCC 大鼠的生存周期并减少肿瘤负荷，通过 UPLC-MS 及网络药理学方法初步预测八宝丹调控 HCC 的作用机制，表明八宝丹具有多成分、多通路、多靶点作用原发性 HCC 的特点，为进一步相关实验研究提供参考。关键词 原发性肝癌；八宝丹；网络药理学；超高效液相色谱-串联质谱；作用机制文章编号 2097-2024（2024）04-0157-08DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202401061Potential mechanism of Babao Dan in the treatment of hepatocellularcarcinomabasedonnetworkpharmacologyZHU Xinyu1,BAI Haoran2,ZHAO Naping1,QI Dachuan2,WEI Lixin3,ZHANG Li1（1.Clinical Research Center,The FirstAffiliated Hospital of Naval Medical University,Shanghai 200433,China;2.Department of Oncology,Longhua Hospital Affiliatedto Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,China;3.National Center for Liver Cancer,Shanghai201805,China）AbstractObjective To explore the potential mechanism of Babao Dan on primary liver cancer based on networkpharmacology.Methods First,the diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma rat（HCC）model was used to observe theeffects of Babao Dan.Then,the effective components in Babao Dan were detected by UPLC-MS,and the potential target sites ofthese effective components were predicted in the Swiss Target Prediction databases,etc.The corresponding target sites for HCCwere screened using GeneCards,OMIM and Therapeutic Target Database,and the common target sites between Babao Dan andHCC were obtained after getting the intersection.The protein-protein interaction network was drawn by Cytoscape software and theSTRING database,and the key molecules regulating HCC by Babao Dan were screened out.The effective target sites weresubjected to GO analysis in the DAVID database and enrichment analysis in the Pathways KEGG.Finally,the clinical relevance ofkey molecules to liver cancer patients was verified by the TCGA database.ResultsBabao Dan could slow down the tumordevelopment.851 chemical components were detected in BaBao Dan by UPLC-MS,9 major active components and 285 target siteswere identified.637 hepatocellular carcinoma-related targets were screened out,and 16 targets of Babao Dan regulating HCC wereidentified.GO enrichment analysis showed 802 biological processes,11 cell compositions,and 43 molecular functions,whileKEGG pathway enrichment analysis identified a total of 90 pathways.Correlation analysis of TCGA identified three key moleculesassociated with the survival of liver cancer patients.Conclusion In the primary rat liver cancer model,Babao Dan was found tosignificantly prolong the survival of cancer-induced rats and reduce tumor burden.The initial prediction of the mechanism by whichBabao Dan regulating liver cancer was made through UPLC-MS analysis and network pharmacology methods,indicating that 基金项目国家自然科学基金（82173276，82073032,82073037,82203237）；上海市卫生健康委员会基金（20214Y0013）作者简介朱鑫宇，硕士研究生，研究方向：临床药学，Tel：[phone]，Email：通信作者张黎，博士，研究员，研究方向：肿瘤免疫与代谢，Tel：[phone]，Email： 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024157 Babao Dan has the characteristics of multi-component,multi-pathway,and multi-target regulation of primary liver cancer,whichcould provide a reference for further relevant experimental research.Keywords hepatocellular carcinoma；Babao Dan；network pharmacology；UPLC-MS；mechanism of action肝癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国特别高发，全球 HCC 患者超过半数在中国。2022 年我国 HCC 发病率达 36.77/10 万人，位于恶性肿瘤第 4 位；总体病死率达 31.65/10 万人，居恶性肿瘤第 2 位1。HCC 已然成为我国一项社会公共卫生问题，严重危害国民健康，给国民经济和社会发展带来沉重负担2-4。目前手术及肝移植可以临床治愈早期 HCC，但多数患者诊断时已是晚期5。尽管免疫检查点抑制剂和小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂联合治疗法为晚期 HCC 患者带来了希望，但患者的中位生存期仅提高至 19.2 个月6。中医药治疗晚期 HCC 有其独特的优势，可以增强化疗、靶向、免疫治疗疗效，减轻毒副作用，改善症状，延长患者总生存期。因此运用中医药探索晚期 HCC 患者的治疗方案，对阻止该疾病的进一步发展，延长患者生存期具有重要的意义。八宝丹起源于明代，至今有近 400 年的应用历史，是原国家食品药品监督管理总局允许使用天然麝香的特效药之一。八宝丹成分包含天然牛黄、天然麝香、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七等。既往研究已证实，八宝丹可用于急慢性肝炎、胆囊炎等肝胆系统疾病，具有清热利湿、祛黄解毒的功效7-8，并且八宝丹对 HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有治疗效果9-10。本团队前期研究发现，八宝丹可以通过抑制慢性炎症介导的肝纤维化进而抑制 HCC 的发生，但八宝丹对于晚期 HCC 的治疗作用机制尚未明确11。因此探寻八宝丹对晚期 HCC 的作用机制可为中医药治疗 HCC 提供证据。二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠模型是一个成熟的原发性 HCC 模型。DEN 模型中 HCC 的发展过程与人类 HCC 相似，是一种非常合适研究 HCC的生物工具12。本研究利用 DEN 大鼠观察八宝丹对 HCC 的影响，发现其能有效延缓 HCC 进展，但是作用机制尚不明确。由于八宝丹成分复杂多样，需要多组学分析技术探明八宝丹中有效药物成分与疾病的互作关系，因此本研究基于网络药理学和 UPLC-MS 方法，筛选八宝丹治疗 HCC 的有效化合物和潜在治疗靶点，构建“疾病基因药物”的多层次网络，揭示八宝丹调控疾病进展的潜在机制，为八宝丹的“老药新用”和 HCC 晚期患者的临床用药提供新思路。1材料与方法 1.1 材料与仪器八宝丹胶囊（批号 Z10940006，厦门中药厂有限公司）、甲醇（A452-4，Fisher）、乙腈（A998-4，Fisher）、甲 酸（A117-50，Fisher）；DEN（245 437,Sigma-Aldrich）；高效液相色谱仪（ACQUITY UPLCI-Class HF，Water）、色谱柱（ACQUITY UPLC HSST3，100 mm2.1 mm,1.8 m,Water）、PDA 检测器（ACQUITY Premier PDA e，Water）；高分辨液质联用质谱仪（Thermo-Obritrap-QE，Thermo）。1.2 方法 1.2.1 HCC 大鼠模型的建立及分组给药将 32 只 SD 大鼠（68 周龄，180200 g，雄性，SPF 级）随机分为 4 组，每组 8 只，分别为：对照组、八宝丹组、DEN 诱导组（DEN 组）、DEN+八宝丹组。DEN 组和 DEN+八宝丹组连续饲喂 12 周DEN 溶液（95 g/ml）,对照组和八宝丹组饲喂灭菌水。八宝丹组不进行 DEN 诱导，从第 12 周开始予以八宝丹给药。DEN 诱导组，DEN 饮水喂养大鼠持续 12 周，诱导 HCC 的发生，然后使用生理盐水灌胃，1 次/2 d，持续 4 周。DEN+八宝丹组，DEN诱导 HCC 发生后，八宝丹按照 0.5 g/kg 的剂量对实验动物进行灌胃，1 次/2 d，持续 4 周（图 1A）。实验结束后处死部分大鼠获取肝脏组织标本，剩余部分停药后继续观察生存期。1.2.2 UPLC-MS 分析八宝丹中的化学成分将八宝丹取出，用液氮研磨均匀后，称取约98.3 mg 样本于 1.5 ml 离心管中；加入 983 l 甲醇-水溶液（V/V=31，含混合内标，4 g/ml），涡旋震荡 1 min，加入钢珠；放入40 冰箱中预冷 2 min后，在研磨机中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴超声提取 60 min，40 下静置 30 min；离心 10 min（12 000 r/min，4），取全部上清液过0.22 m 的有机相滤膜；4 下静置过夜，离心 10 min（12 000 r/min，4），取上清液过 0.22 m 的有机相滤膜置于内衬管的 LC-MS 进样小瓶中进行分析。本次实验的分析仪器为 ACQUITY UPLC I-Class HF 超高效液相串联 QE 高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱条件：色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm2.1 mm,1.8 m）；柱温：45；流动相：水（含 0.1%甲 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 158Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024 酸）和乙腈，梯度洗脱信息详见表1；流速：0.35 ml/min；进样体积：5 l；PDA 扫描范围 210400 nm。质谱条件：离子源（HESI，样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式）；数据采集模式为 DDA；扫描方式为 Full MS/dd-MS2（TOP 8）；质谱参数详见表 2。表1八宝丹梯度洗脱信息 时间（t/min）水（含0.1%甲酸）（%）乙腈（%）09552955470308505010208014010015010015.195516955 表2Thermo-Obritrap-QE 质谱参数信息 参数正离子负离子喷雾电压（U/V）3 8003 000毛细管温度（T/C）320320辅助气体加热器温度（T/）350350鞘气流量（Arb）3535辅助气体流速（Arb）88S透镜射频水平5050质量范围（m/z）1001 2001001 200全质谱分辨率70 00070 000串联质谱分辨率17 50017 500质谱仪二级碎裂能量10，20，4010，20，40 1.2.3 八宝丹有效化学成分筛选策略八宝丹 UPLC-MS 数据由上海欧易生物医学科技有限公司提供，根据八宝丹化学成分在 210 nm和 254 nm 波长下的紫外吸收图初步确定其结构类型。质谱数据经 Progenesis QI v3.0 软件（NonlinearDynamics,Newcastle,英国）处理（基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化）获得八宝丹的质谱峰表。1.2.4 八宝丹有效成分鉴定方法八宝丹的质谱峰表中化合的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，并结合 TCM 数据库（上海欧易生物医学科技有限公司，中国）进行鉴定。在本研究中，质谱峰表中对各鉴定物质进行评分，满分 80 分，其中，一级质谱精确分子量匹配，20 分；二级质谱碎片匹配，20 分；同位素分布匹配，20 分；保留时间匹配，20 分。将化合物相对峰面积的总含量定为 100%，得到定性定量结果数据矩阵，并规定峰面积的比值大于 1%，总分大于 55，一级分子量误差在 1.4106以内的化合物作为八宝丹的有效成分进行后续分析。1.2.5 八宝丹中有效化学成分靶点的筛选根据前期筛选出的有效化学成分导入 PubChem（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查找与有效活性成分相对应的 Smiles 号，并将 Smiles 号导入 Swiss Target Prediction（http:/swisstargetprediction.ch/）和 SuperPred（https:/prediction.charite.de/subpages）数据库进行有效活性成分对应靶点的预测，保留结合可能性 1%以上或文献报道过与化合物相关的作用靶点。根据各成分相关基因富集情况，利用 R（version 3.6.1）构建各组分之间互作网络。1.2.6 HCC 相关靶点的筛选使用 GeneCards（https:/www.genecards.org/）数据库、OMIM（https:/omim.org/）数据库和 TherapeuticTarget Database（https:/ HCC 对应靶点，以“Hepatocellular carcinoma”为关键词进行筛选。并根据文献比对，保留与 HCC 相关的靶点用于后续研究。1.2.7 有效成分与 HCC 互作分析根据前期有效成分相关靶点筛选和 HCC 相关靶点的选择，取交集进行后续分析。将共同靶点的数据导入 STRING 数据库（https:/cn.string-db.org/）构建蛋白互作网络，再利用 Cytoscape3.9.0 软件，以介数中心数为参考，筛选出关键调控蛋白。1.2.8 GO 功能注释及 KEGG 通路富集分析将有效成分和 HCC 之间的共有靶点导入DAVID（https:/david.ncifcrf.gov/）数据库，设置物种为人，P0.01，分别勾选 GO 分析中的生物过程、细胞组成、分子功能以及 Pathway 中的 KEGG 进行富集分析，提取结果后，应用微生信（http:/ TCGA 相关性分析将有效成分和 HCC 之间的共有靶点依次导入 GEPIA2（http:/gepia2.cancer- 182例 TCGA 数 据 库 中 保 留 的 临 床 HCC 患 者 的RNA 测序数据为基础，分析共有靶点与患者生存期的相关性。1.2.10 H&E 染色大鼠被处死后，用磷酸盐缓冲盐水和 4%多聚甲醛进行经心灌注。取肝脏组织进行病理评估。药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024159 石蜡包埋后肝脏切成 5 m 厚的切片。染色时将HCC 组织石蜡切片，60 烘烤固片 30 min；脱蜡至水，并按照生产商的方案用苏木精-伊红染色，最后镜下观察各组织病理学情况。1.2.11 统计学方法使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行方差分析，每次实验的定量数据以平均值标准差表示，组间差异采用 t 检验。Kaplan-Meier 分析用于进行生存期分析。采用对数秩检验比较各组存活时间。以P0.05 为差异有统计学意义。2结果 2.1 八宝丹延长原发 HCC 大鼠生存期并减少肿瘤负荷在实验观察期间，对照组和八宝丹组的大鼠均存活，而 DEN 组平均生存期为 17.1 周，DEN+八宝丹组平均生存期为 23 周，是 DEN 组的 1.35 倍（图 1B）。同时观察肝脏大体发现，对照组和八宝丹组肝脏组织未见异常；DEN 组肝脏组织中均出现大量肉眼可见肿瘤结节；而 DEN+八宝丹组肝脏组织中虽然出现了部分肉眼可见的肿瘤结节，但大体形态上相较于 DEN 组损伤较轻（图 1C）。通过对肿瘤结节的最大直径和数量测量统计发现DEN+八宝丹组肿瘤负荷和最大肿瘤直径显著小于 DEN 组（图 1D）。同时，对各肝脏组织进行病理学评估和 H&E 染色结果发现，八宝丹组和正常肝脏组织组织排列紧密，未出现肝脏损伤，而 DEN 组出现明显的组织空泡化，组织间排列弥散，肝脏损伤严重。尽管 DEN+八宝丹组大鼠肝脏组织相较于八宝丹组和正常对照大鼠出现了明显的炎症浸润和肝纤维化，但是，相较于 DEN 组的肝脏组织损伤较轻且组织排列较为紧密（图 1E）。H&E 染色结果表明，八宝丹对大鼠肝脏未发现实质性病理损伤，并且缓解了同期 DEN 大鼠的肝脏病理状态。上述结果表明，八宝丹能延缓 DEN 大鼠的生存期并减少肿瘤负荷，但是具体机制尚不明了。ACEBDSD大鼠(雄性)饮水摄入DEN/生理盐水处死周数对照组对照组八宝丹组DEN组DEN组DEN组BBD组DEN+八宝丹组对照组八宝丹组DEN组DEN+八宝丹组DEN+八宝丹组DEN+八宝丹组DEN组DEN+八宝丹组012131415161 cm100 m100 m100 m100 m1 cm1 cm1 cm1.00.80.60.40.200102030生存率时间(t/周)503.02.52.01.51.00403020100肿瘤负荷(n)最大肿瘤直径(l/mm)灌胃生理盐水/八宝丹(0.5 g/kg)*图 1八宝丹对 HCC 大鼠的影响A.动物模型的构建与八宝丹干预策略机制图；B.Kaplan-Meier 总生存曲线；C.各组间代表性肝脏大体观，黄色箭头指示肿瘤结节；D.定量分析 DEN 组和 DEN+八宝丹组大鼠肝组织肿瘤结节数和最大肿瘤结节直径（meanSD，n=3，*P0.01，与 DEN 组比较）；E.H&E 染色各组间代表性肝脏组织切片 2.2 八宝丹可能通过多种化合物和多靶点调控 HCC的进展为进一步探索八宝丹对 HCC 的影响机制，本研究首先对八宝丹进行 UPLC-MS 中药化学成分检测。中药成分鉴定流程如图 2A 所示，将八宝丹颗粒进行溶解、研磨、过滤和提纯后上机检测。紫 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 160Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024 外吸收图谱发现，210 nm 处皂苷类成分在该波长下有强吸收，254 nm 处含有苯环、双键等结构的成分在该波长下有强吸收。然后通过基峰色谱图反应样品的整体信息，3 次重复性检测结果可知该检测方法离子相应响度、保留时间重复性良好，由此说明本次实验仪器稳定、数据可靠。原始数据经Progenesis QI 软件处理和 TCM 数据库进行定性后，共发现 851 个中药成分，保留 9 个主要活性成分供后续研究，分别是牛磺草胆酸盐、12-酮脱氧胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸、三七皂苷 R1、环氧油酸和 3,7-二羟基-12-羰基-5-胆烷酸。将主要活性成分信息分别导入PubChem 和 Swiss Target Prediction 数据库，共获得 285 个潜在作用靶点，并绘制出化合物之间的互作网络，发现八宝丹中主要化学成分之间关系密切，相互存在多个共有靶点（图 2B）。在 TherapeuticTarget Database、GeneCards、OMIM 数据库和文献中共筛选出与 HCC 相关的靶点 637 个，保留八宝丹与 HCC 共有相关性靶点 16 个（图 2C）作为潜在调控分子。将潜在调控分子导入 STRING 数据库构建蛋白与蛋白间互作网络（图 2D），再利用Cytoscape3.9.0 软件，以介数中心数（网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目占最短路径数的比例）为参考，将潜在调控分子进行排序，介数中心数越大，圆形的直径越大，颜色越蓝，说明在该网络中的关联度就越高，反之圆形的直径越小，颜色越绿（图 2E）。其中，潜在调控分子介数中心数排名前 5 的分别是：白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、细胞肿瘤抗原 p53（TP53）、过氧化酶增殖因子活化受体-（PPARG）和雌激素受体 1（ESR1）。2.3 八宝丹临床上可能通过多途径影响 HCC为探索八宝丹调控 HCC 的潜在作用机制，本研究基于 DAVID 数据库将上述 16 个共有相关靶点进行 GO 及 KEGG 富集分析。GO 富集分析显示 802 个生物过程、11 个细胞组成、43 个分子功能，KEGG 通路富集分析共 90 条通路，展示排名前 10 的富集条目。图 3A 提示八宝丹在生物过程中通过沉默细胞中 mRNA 的转录，抑制上皮样细胞的增殖和转录因子的结合调控 HCC；图 3B 提示八宝丹有效化学成分在细胞层面上通过结合各种细胞器或细胞膜受体发挥作用；图 3C 提示八宝丹有效化学成分能调控转录因子的结合、细胞因子的分泌及细胞核的状态。图 3D 提示八宝丹调控 HCC 是通过多通路、多靶点之间的相互作用。最后在 TCGA 数据库中查询了共有相关靶点与 HCC 患者的临床相关性，在 182 例临床样本的调查中发现，3 个基因的高表达提示着患者的总生存期较短，分别为 ESR1（Logrank P=0.000 69）、PPARG（Logrank P=0.000 74）和 COL18A1（Logrank P=0.006），详见图 3EG，P 值由Kaplan-Meier 生存曲线和log-rank 检验确定。3讨论HCC 是一种典型的炎症相关癌症，近 90%的HCC 与病毒性肝炎、过度酒精摄入、非酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝引起的长期炎症相关。在HCC 慢性炎症微环境中，先天免疫细胞和成纤维细胞被募集并激活至损伤部位分泌细胞因子和生长因子，有利于肿瘤细胞的增殖或抵消凋亡6。研究表明，NF-B 和 JAK-STAT 两条经典通路是促进 HCC 的关键炎症信号通路，抑制炎症通路的激活能有效抑制住 HCC 进一步进展13。八宝丹作为传统中药复方，临床上已发现对 HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有着积极的治疗效果，但是具体机制尚不明了。本团队前期研究发现，八宝丹可以通过抑制炎症细胞因子分泌和减少肝前体细胞上 TRL4 的表达，从抑制肝前体细胞的肿瘤转化，进而抑制肿瘤发生11。因此本研究团队假设八宝丹减缓了原发性 HCC 的肿瘤进展。在本研究中，通过观察八宝丹对 DEN 诱癌大鼠的影响，发现八宝丹可以延长 DEN 大鼠的生存期，并且缓解 DEN 导致的肝脏肿瘤负荷。但是，目前尚未有具体的机制阐明这一现象。为探索是八宝丹中何种中药成分发挥了作用，利用 UPLC-MS 技术检测出化学成分 851 个，鉴定出主要活性成分 9 个，其中大部分是人体胆汁酸中主要成分，也发现具有强抗炎作用的三七皂苷 R114，主要活性成分之间关系密切。共筛选出 285 个潜在作用靶点。在与 HCC 相关靶点取交集后，筛选出八宝丹调控 HCC 的 16 个潜在靶点。利用上述靶点构建了八宝丹“化学成分-潜在靶点”网络模型以及PPI 网络，将潜在作用靶点进行排序，发现了HCC 小鼠模型已验证能加速 HCC 的发展并影响肿瘤的侵袭性免疫信号 IL-6 和 TNF15；HCC 中的显性突变驱动因子 TP53 和 RB116；与 HCC 炎症相关的信号分子 STAT3；与肿瘤细胞增殖相关的分子 MTOR 和 AFP17。GO 富集分析结果提示，八宝丹调控 HCC 在生物过程上参与 miRNA 对基因的沉默负调控、转录后 miRNA 对基因的沉默负调控、RNA 对基因的 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024161 沉默负调控等；在细胞组分上富集到 RNA 聚合酶转录调节因子复合物、吞噬作用相关受体、细胞膜受体等词条；在分子功能上富集到与转录起始因子结合，激活核受体，与配体结合激活转录因子活性等。KEGG 信号通路提示，八宝丹参与了癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、HIF-1 信号通路、化学致癌受 体 激 活、EGFR 络 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 耐 药 等通路。TCGA 数据库中发现，ESR1、PPARG 和COL18A1 高表达与 HCC 患者总生存期密切相关。据报道，PPARG 高表达可激活 WNT/CTNNB1 信 ABCDEPIK3CAAFPCOL18A1CPT1AMPOPLA2G2ARB1IL6TNFTP53PPARGESR1STAT3MTORTLR4ARPIK3CAARMTORRB1STAT3ESR1PPARGCPT1APLA2G2AIL6TNFCOL18A1MPOAFPTLR4TP53270(29.9%)617(68.3%)16(1.8%)检测BBDUPLC-MSBPC基峰图去氧胆酸甘氨胆酸12-酮脱氧胆酸牛磺草胆酸盐牛磺胆酸胆烷酸三七皂甙R1环氧油酸甘氨脱氧胆酸321004812163210吸光度(A)32101.000.750.500.250吸光度(A)吸光度(A)BPC(正离子模式)BPC(负离子模式)BBD样本-1BBD样本-1BBD样本-2BBD样本-3时间(t/min)0481216时间(t/min)0481216时间(t/min)0481216时间(t/min)1.000.750.500.250吸光度(A)BBD样本-20481216时间(t/min)1.000.750.500.250吸光度(A)BBD样本-30481216时间(t/min)吸光度(A)图 2八宝丹通过多化学成分和多靶点对原发 HCC 的影响A.八宝丹检测流程示意图及基峰色谱图（红、蓝、绿色表示三针技术重复）；B.八宝丹中有效中药成分相互作用玹图；C.韦恩图显示八宝丹与 HCC 共有相关性靶点；D.基于 STRING 数据库绘制的蛋白与蛋白间互作网络；E.基于介数中心数为参考绘制的蛋白与蛋白间互作网络 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 162Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024 号通路，从而维持肿瘤细胞干性特征，促进癌症进展18。人类 HCC 临床样本调查和组织染色也证实，ESR1 可通调控 miR-141-3p/GSN 信号影响原发性 HCC 进展19；肌成纤维细胞分泌的胶原-1（）链（COL18A1）可促进肿瘤转移，加速HCC 进展20。因此 TCGA 结果提示，八宝丹可能是通过调控 ESR1、PPARG 和 COL18A1 来延长原发性 HCC 患者的生存期。综上所述，本研究证实了八宝丹对治疗原发性 HCC 的积极影响，并且发现 9 种八宝丹的有效 A参与miRNA对基因沉默的负调控参与转录后基因沉默的负调控参与RNA对基因沉默的负调控参与基因沉默的负向调控参与上皮细胞增殖参与基因沉默的miRNA产生的负调控参与基因沉默的mi RNA产生的调控参与RNA基因沉默的小RNA的调控参与DNA结合转录因子激活的正调控参与DNA结合转录因子激活调控051015生物过程 富集评分(lgP)G 1.00.80.60.40.20020Logrank P=0.006406080100120时间(t/月)低表达COL18A1组高表达COL18A1组生存率(%)F1.00.80.60.40.20020Logrank P=0.00074406080100120时间(t/月)低表达PPARG组高表达PPARG组生存率(%)E1.00.80.60.40.20020Logrank P=0.00069406080100120时间(t/月)低表达ESR1组高表达ESR1组生存率(%)DPPARGARCPT1ARB1IL6VEGFASTAT3MTORPIK3CATLR4TP53TNFESR1癌症中的蛋白聚糖人类巨细胞病毒感染大小胰腺癌乙型肝炎胰岛素抵抗化学致癌相关受体激活EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性乙型肝炎HIF-1信号通路人类巨细胞病毒感染胰岛素抵抗卡波肉瘤相关疱疹病毒感染脂质和动脉粥样硬化胰腺癌癌症中的蛋白聚糖卡波肉瘤相关疱疹病毒感染化学致癌-受体激活脂质和动脉粥样硬化EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性HIF-1信号通路5678分类与与与RNARNARNA与转录起始因子结合数量P值激活核受体与配体结合激活转录因子活性聚合酶转录起始因子结合基础转录机制组分结合聚合酶基础转录机制组分结合与类固醇激素受体结合聚合酶的特异性转录因子结合与细胞因子受体结合与核受体结合C4567分子功能 富集评分(lgP)3.003.253.503.754.00810-5610-5410-5210-5PML体吞噬作用转录调控因子复合体线粒体外膜细胞器外膜细胞外膜能催化磷酸基团转移的转移酶复合物吞噬囊泡周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物012345细胞组分 富集评分(lgP)BRNA聚合酶转调节因子复合物图 3富集分析发现八宝丹临床上可能是通过多途径影响 HCCA.生物过程富集分析柱状图；B.细胞组分富集分析柱状图；C.分子功能富集分析气泡图；D.KEGG 富集分析花瓣图；E.ESR1 与 HCC 患者总生存期的关系图；F.PPARG 与 HCC 患者总生存期的关系图；G.COL18A1 与 HCC 患者总生存期的关系图 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024163 活性成分。还利用网络药理学的研究方法，分析揭示八宝丹可能是通过多靶点、多通路来调控原发HCC，并结合已有的研究进行分析验证，提出新的视角与思路，为后续的实验研究提供参考。【参考文献】ZHENG R S,CHEN R,HAN B F,et al.Cancer incidence andmortality in China,2022J.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2024,46（3）：221-231.1 RUMGAY H,ARNOLD M,FERLAY J,et al.Global burden ofprimary liver cancer in 2020 and predictions to 2040J.J Hepa-tol,2022,77（6）：1598-1606.2 TORRE L A,BRAY F,SIEGEL R L,et al.Global cancer statis-tics,2012J.CA A Cancer J Clin,2015,65（2）：87-108.3 SIEGEL R L,MILLER K D,WAGLE N S,et al.Cancer statis-tics,2023J.CA A Cancer J Clin,2023,73（1）：17-48.4 BROWN Z J,TSILIMIGRAS D I,RUFF S M,et al.Manage-ment of hepatocellular carcinoma:a reviewJ.JAMA Surg,2023,158（4）：410-420.5 G