基因工程原理习题与答案.doc

基因工程原理习题集1、DNA分子克隆技术：克隆，指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程。DNA分子克隆技术也称基因克隆技术，是在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接,转入细胞获得大量拷贝的过程。其基本步骤包括:制备目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达.载体在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库,一种是基因组文库，另一种是cDNA库。2、分子杂交：两条不同来源的DNA（或RNA)链或DNA与RNA之间存在互补顺序时，在一定条件下可以发生互补配对形成双螺旋分子，这种分子称为杂交分子.形成杂交分子的过程称为分子杂交。3、限制性片段长度多态性:从不同个体制备的DNA，使用同一种限制性内切酶酶切，切得的片段长度各不相同。酶切片段的长度可以作为物理图谱或者连接图谱中的标记子。通常是在酶切位点处发生突变而引发的。4、报告基因：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因、5、多聚酶链式反应（PCR)：一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两个单链引物。以过高温变性将模板DNA分离成两条链.低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸,反应液的游离核苷酸紧接着引物从5/端到3/端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增.6、核酸的凝胶电泳:将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的摩擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等)。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态.将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极向正极移动.在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭进行染色，此时,核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。7、细菌转化：所谓细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致遗传特性发生改变的过程.这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的菌株则叫做受体菌株。大肠杆菌是使用最广泛的实验菌株。8、反义核酸:指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合的一段DNA或RNA。9、RNA interference：是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA 导入细胞后，能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制范畴.10、Spi：噬菌体体重组克隆的一种筛选方法,其筛选方法是Spi+:不能感染E.coli（p2）； Spi-：（red gam）能感染E.coli(p2），形成小噬斑/host recA+/chi。包装时若gam- ，需recA产物的作用才可形成噬斑（但为小噬斑）,所以对宿主菌有要求(recA+）但recA+可引起其它重组:载体改为red/gam+可在recA受体中增殖。11、DNA文库:将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞,进行克隆.这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因.12、cDNA:cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。13、cDNA文库:以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库.14、DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。15、转导（作用）：借助于病毒载体，遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞。16、染色体步移：通过相互重叠的基因组克隆之间进行一连串杂交从而实现染色体上基因的定位。17、斑点杂交:将被检标本点到膜上,烘烤固定后与探针进行杂交。这种方法耗时短,可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品.18、complementation：质粒载体重组克隆的筛选方法，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。LacZM15 :放在F质粒上，随宿主传代;LacZ ：放在载体上，作为筛选标记。19、菌落原位杂交：将细胞从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。20、核酸原位杂交：标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交的方法。21、限制性内切酶:识别DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。22、酶切位点:DNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA酶切成两段。23、DNA连接酶:催化DNA中相邻的5/磷酸基与3/羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切囗封合,连接DNA片段。24、持家基因:是指对所有类型组织细胞在任何时候都需要其表达的基因，通常都是维持细胞基本生存所必须的基因，其表达常保持在固定的水平.又称为组成性表达基因.25、奢侈基因：只在某特定的细胞类型中表达或者说只在发育阶段的某些时期表达的基因叫做奢侈基因。26、Tm值：是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔解温度,系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度.27、分子标记：广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）.狭义的分子标记是指能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点的DNA片段。28、基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的重新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达的过程.29、载体:是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。30、卫星DNA:又称短串联重复，26个核苷酸组成的重复单位串联重复（1060次)，两侧为特异的单拷贝序列,人类基因组中每10kbDNA序列至少有一个STR序列。31、多克隆位点：DNA中含有两个以上密集的、能被多种限制性内切酶识别和切割的位点区。32、定位克隆：也称为图位克隆,是在获取基因在染色体上的位置信息后，采用各种实验方法对基因进行克隆和定位。定位克隆包括定位和克隆两个过程，定位是通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置,克隆是从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能.也可以回答为“通过遗传标记先获得某一表型基因在染色体上的定位,再在候选区域内选择已知基因,进行突变的筛选，并获得cDNA及全基因的过程。33、基因芯片:基因芯片又称为DNA微阵列，以基因序列为分析对象的微阵列,是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。34、RTPCR：是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获取目的基因或检测基因表达。主要用于分析基因的转录产物，克隆cDNA及合成cDNA探针,改造cDNA序列等。35、锚定PCR：用于在体外扩增未知序列的DNA片段的方法,一般的PCR必须预先知道欲扩增DNA片段两侧的序列,但人们经常需要分析一端序列未知的基因片段,可利用锚定PCR。该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对的特异引物参与下，扩增带有同聚物尾的序列。锚定引物PCR对分析未知序列基因有特殊用途.36、反向PCR:常规PCR可扩增位于两个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可扩增引物外侧的DNA片段，对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究.其原理为:先用一种在目标DNA区段上没有识别位点的限制性内切酶从距离目标DNA一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片断进行分子内连接形成环,根据已知的目标DNA序列按照向外延伸的要求设计一对向外引物,保证被扩增的是目标DNA区段两侧的未知序列.37、多重PCR:在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同DNA片段,如果基因某一区段缺失,则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物消失，从而发现基因异常.多重PCR具有灵敏、快速的特点，特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与southern blotting一样可靠。38、质粒:是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做载体.39、粘粒载体：也叫柯斯质粒，是一类人工构建的含有DNA的cos序列和复制子的特殊特殊类型的质粒载体.40、穿梭质粒载体：是人工构建的一类具有两种不同复制起点和选择记号,因而可以在两种不同寄主细胞中存活和复制的质粒载体.41、基因突变：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变.42、逆转录酶：在体内、外均能转录病毒性RNA成为DNA，称为依赖RNA多聚酶,即为逆转录酶。分布在病毒的类核内。逆转录酶与三种功能有关：使RNA一DNA杂合双链形成；切除杂合双链中的RNA链；进而再生成DNA一DNA的双链。43、扣除杂交：就是用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交,先扣除一般共有的cDNA，再将剩下的特异的cDNA进行克隆，用此方法已成功克隆出控制动物胚胎发育和组织分化的基因。44、测序酶为修饰的T7 DNA polymerase,9935外切活性被除去（Version1。0)；完全除去（V 2.0）；用于测序反应(测序酶）.45、YAC载体酵母人工染色体载体；含酵母染色体复制起点ori，自主复制序列ARS；着丝粒（CEN）;两个端粒(TEL）。用于克隆50kb以上甚至Mb(200-500kb).原生质体电转化,URA3trpade21赭石突变酵母菌，红色菌落插入失活。46、同尾酶一类产生相同粘性末端的限制性内切酶.47、cI筛选法C基因发生突变时不能溶源化，C- ：在hflA（高频溶源化）中形成噬斑.C+在hflA中形成溶源，产生混浊噬斑。48、Sanger测序即酶法测序,用双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。49、同裂酶：DNA经限制性内切酶切割后，产生相同粘性末端，这类限制性内切酶称为同裂酶。50、复制起点：DNA复制的起始位点，DNA复制在起始位点处形成复制叉进行双向复制，通常DNA复制的起始DNA序列存在重复倒位序列。51、启动子：启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位.在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序,称为10和35序列。这两个序列的共同顺序如下,-35区“AATGTGTGGAAT”，10区“TTGACATATATT”.大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence）,只有少数几个核苷酸的差别.52、起始密码子:AUG不仅是Met或者fMet（在原核细胞)的密码子，也是肽链合成的起始信号，故称AUG为起始密码子。53、起始因子:在蛋白质生物合成的起始阶段与核糖体亚基结合，起始蛋白质的合成.在E.coli中已分离出三种IF。IF1、IF2和IF3。其中,IF3具有形成三元复合物和解离因子活性,使70S核糖体颗粒解离为30S和50S亚基；IF2形成30S前起始复合物；IF1无特异功能，但具有加强 IF2和IF3的活性作用.54、复制终点DNA复制的终止位点,DNA复制在起始位点处形成复制叉进行双向复制，在终止位点处终止DNA复制，通常DNA复制的终点DNA序列存在重复倒位序列。55、终止子：细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子。作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。56、终止密码子:UAA、UAG和UGA为终止密码子，不代表任何氨基酸,也称为无意义密码子.57、终止因子:蛋白质肽链合成的终止因子,在E。coli中已分离出三种释放因子。RF1，RF2和RF3。其中,只有RF3与GTP（或GDP）能结合。它们均具有识别mRNA链上终止密码子的作用,使肽链释放,核糖体解聚.二、选择题1、对限制性内切酶的作用，下列哪能个不正确？- A、识别序列长度一般为46bp B、只能识别和切割原核生物DNA分子 C、识别序列具有回文结构 D、切割原核生物DNA分子2、1、同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时,它们的迁移速率是：A、OC DNASC DNA L DNA。 B、SC DNA L DNAOC DNA。C、L DNAOC DNASC DNA。 D、SC DNAOC DNAL DNA.3、下列关于基因克隆操作方法的叙述哪一个是不正确的。A、选择合适的限制酶,使其在特定的位点切开DNA分子。B、选择能够进行自我复制的小分子DNA作为载体DNAC、基因克隆就是分子杂交D、制备所需要的DNA片段，用DNA连接酶使其和载体DNA连接成重组DNA。4、酵母双杂交体系被用来研究_ A、哺乳动物功能基因的表型分析 B、酵母细胞的功能基因 C、蛋白质的相互作用 D、基因的表达调控5、有关反转录的正确叙述是_ A、反转录反应不需要引物 B、反转录后的产物是cDNA C、反转录的模板可以是RNA，也可以是DNA D、合成链的方向是3/5/6、关于禽类RNA病毒逆转录酶有关活性的描述，正确的选择是_ A、DNA聚合酶活性，3/5/的外切酶活性，DNA旋转酶活性 B、DNA聚合酶活性，5/3/的外切酶活性,DNA旋转酶活性 C、DNA聚合酶活性,DNA内切酶活性，DNA旋转酶活性7、用于分子生物学和基因工程研究的载体必须具备两个条件_ A、含有复制原点，抗选择基因 B、含有复制原点,合适的酶切位点 C、抗性基因,合适的酶切位点8、关于核酸电泳的叙述，错误的是?_ A、泳动速率与分子构象有关 B、聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率最高 C、分子泳动的方向与净电荷有关 D、泳动速率与分子大小有关9、mRNA的序列是5/ACUGAGCU3/，那么通过反转录合成的cDNA的序列应该是：_ A、5/TGACTCGA3/ B、5/AGCTCAGT3/ C、5/AGCUCAGU3/ D、5/ACTGAGCT3/10、PCR实验的特异性主要取决于_ A、DNA聚合酶的种类 B、反应体系中模板DNA的量 C、引物序列的结构和长度 D、四种dNTP的浓度11、下列关于限制性核酸内切酶的叙述哪一个是不正确的?A、限制性内切酶存在于许多种细菌中B、限制酶的功能是识别和降解外来的DNAC、限制酶是识别和降解DNA的酶的总称D、限制酶能识别DNA分子上特定的核苷酸序列并在特定的位点切割DNA12、下列关于cDNA文库与基因组文库的叙述中，哪一项是不正确的? A、cDNA文库代表了mRNA来源 B、从不同类型细胞制备的cDNA文库可用于分离差异表达的基因 C、cDNA文库代表的所有的DNA，适合于研究基因结构和调节 D、基因组文库在理论上均等的代表了所有基因序列13、下列关于DNA连接酶的叙述哪一个是不正确的?A 、催化DNA链中相邻的3OH末端和5磷酸基之间形成磷酸二酯键。B、在DNA的体外重组中,用于具有粘性末端DNA分子之间的连接.C、在DNA的体外重组中,用于平末端DNA分子之间的连接.D、催化DNA链中的5-OH末端和3磷酸基之间形成磷酸二酯键。14、下列关于DNA克隆载体的叙述哪一个是不正确的？A、应是宿主细胞本来就具有的或是宿主细胞完全可接受的DNA分子B、载体DNA都应具有两个或两个以上的抗生素抗性C、它不仅能在宿主细胞内独立地进行复制，而且也能复制它所连接的DNA分子D载体DNA经与外源DNA连接后，仍不失自我复制能力15、下列关于克隆载体质粒的叙述哪一个是错误的？ A、质粒是细菌染色体外的遗传因子,一般为双链环状的DNA分子B、质粒在细胞内能自主地进行复制C、质粒上都有产生大肠杆菌素的基因D、通过“转化”，质粒进入细胞后,能使受体菌获得新的遗传特性 16、下列关于质粒pBR322DNA的叙述哪一个是错误的？ A、它的分子量较小，易于进入细胞B、含有抗四环素(TetR)和抗氨苄青霉素(AmpR)的基因C、若用EcoRI切割该质粒,不破坏它的两个抗生素抗性基因D、用BamHI限制酶切割pBR322质粒,将破坏它的抗氨苄青霉素基因17、下列关于克隆载体细菌人工染色体BAC的叙述哪一个是错误的？A、能插入几百kb长的DNA片段B、它含有抗四环素的选择性标记。C、它含有抗氯霉素的选择性标记（CmR）.D、具有一个稳定的复制原点,可独立地进行复制18、下列关于克隆载体噬菌体的叙述哪一个是错误的？A、噬菌体侵染大肠杆菌，可以在宿主细胞内增殖。B、噬菌体基因组中13的DNA是非必须的，可以用外来的DNA替换之.C、允许插入噬菌体的DNA片段的长度不限D、 噬菌体侵染大肠杆菌可通过溶源途径使它的DNA整合到宿主基因组上19、下列关于PCR的叙述哪一个是不正确的? A、是Mullis于1984年发明的一种体外扩增DNA的技术.B、根据DNA复制的基本原则，反应体系中需加入RNA聚合酶以合成引物.C、在PCR反应体系中,需要特定的引物、dNTP、镁离子等。D、需要模板DNA，即扩增的DNA片段。20、下列关于基因工程技术的叙述哪一个是不正确的?A、基因工程技术也称“DNA重组技术”、“基因克隆”或“基因操作技术。B、基因工程技术俗称“遗传工程”.C、基因工程技术需要限制性内切酶、DNA连接酶等D、基因工程技术实验发生于1965年。21、下列关于农杆菌Ti质粒的叙述哪一个是错误的？ A、它存在于根癌农杆菌细胞内.B、该质粒上的TDNA片段能够被整合进植物细胞染色体。C、它的T-DNA片段上含有参与植物生长激素和冠瘿碱合成的基因.D、它存在于所有的土壤农杆菌细胞内。三、填空题1、大部分真核基因都是由蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列两部分组成,其中编码序列称为_，非编码序列称为_，在一个结构基因中，由于编码蛋白质的部分常被非编码序列隔开,所以，真核基因也被称为_.2、在噬菌体基因组中，目前发现的基因有60多个,其中一半左右参与了噬菌体生命周期的调控，这类基因称为_,另外一部分基因称为_.3、一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性特征发生遗传改变的过程叫做_ ，提供DNA的菌株叫_，接受DNA的菌株叫 _。4、PCR反应主要有_、_、_三个步骤5、为了防止DNA的自身环化,可用_脱去双链DNA_。6、基因工程中常用的载体有_、_、_。7、YAC载体容载能力是_,BAC载体的容载能力是_。8、用于电泳分离DNA或RNA的凝胶有_、_其中_可区分1bp的DNA。9、DNA探针标记的方法有_、_。10、EcoR识别和切割位点是_,BamH识别和切割位点是_，Sau3A识别和切割位点是_。11、反转录酶除具有催化的合成外,还具有_的作用，可将杂种双链中的_水解掉。12、质粒载体容载能力是_，噬菌体载体的容载能力是_。13、不同构型的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度_，OC DNA泳动速度_，L DNA泳动速度_。14、噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是_，而来自噬菌体的主要结构是_。四、判断题1、所谓引物就是同DNA互补的一小段RNA分子。2、核酸分子在电场中向正极移动，蛋白质向负极移动。3、哺乳动物某一类型细胞中，只有大约10的mRNA是该类型所特有的,这类基因称为持家基因。4、逆转录酶以RNA或DNA为模板以tRNA为引物合成DNA。五、说明题(下列各项在基因工程中的主要作用或功能)1、聚丙酰胺凝胶:2、pUC118噬菌粒载体:3、T4多核苷激酶：4、Ti质粒5、 dNTP6、琼脂糖:7、DNA探针：8、碱性磷酸酶:9、IPTG10、x-gal六、问答题1、分子标记是怎样逐步演化的？2、限制性核酸内切酶有哪能几种类型？哪一种类型的限制酶最适合于基因工程，为什么？请简要说明理由、3、生产限制性内切酶的细菌如何保护自己的DNA不被降解？4、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？5、某重组体的插入片段为线状双链，长度为10.0kb,被限制性核酸内切酶A和B降解的产物经凝胶电泳分级分离后结果如下： （1）酶A单独消化时,得到1。5kb和8.5kb的2个片段 （2）酶B单独消化时，得到0。5kb、3.0kb、6。5kb的3个片段 (3）酶A和酶B一起消化时，得到0.5kb、1.0kb、2。0kb和6。5kb的4个片段根据上述信息画出该插入片段的限制性内切酶图谱.6、简述重组DNA（基因工程）的主要步骤7、简述分子克隆的基本步骤8、说明基因克隆的一种方法9、何为基因工程?试述其对遗传学的意义10、在进行基因工程时，载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞扩增和表达的工具，请问一个载体应具有那些基本特性和结构特点？11、重组DNA技术的发展与载体的发现和研究密切相关,作为载体应当具备哪些条件?12、什么是cDNA文库？同基因组文库有何差别？13、建立一个基因文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆？14、简述cDNA文库的构建过程15、简述PCR相关技术及应用16、PCR与细胞内DNA复制两者有哪些主要的相同点和不同点，各举出5个17、PCR反应包括哪些基本要素?18、基因工程中常用一互补来筛选重组质粒，请说明其原理、19、RFLP的中英文名?20、说明基因芯片的工作原理及其在生物学研究中的意义21、什么是管家基因？有何意义?22、说明报告基因的一种用途23、核酸原位杂交的基本步骤有哪些？24、DNA分子标记有哪些种类?25、重组的类型有哪些?26、说明PCR反应的基本原理并列举几种特殊的PCR方法27、核酸分子探针有哪些种类？试说明各类探针的特点28、非放射性标记物的优点是什么？有哪几类非放射性标记物？合成非放射性核酸探针的方法有哪几种?29、核酸分子杂交中有哪些常用的滤膜杂交方法、试举一例说明其原理30、如何进行启动子的结构与功能分析?31、用从总RNA中分离mRNA的原理是什么？32、什么是限制性内切核酸酶的星星活性?受哪些因素影响？33、下面是一个基因工程质粒载体形体图，请指出这个载体各部分（虚线箭头所指)的功能？并说明这个载体的在基因克隆中的用途和工作原理？34、下面是一个基因工程质粒载体形体图，请指出这个载体各部分（虚线箭头所指）的功能?并说明这个载体的在基因克隆中的用途和工作原理？35、已知一个蛋白质的氨基酸序列,如何克隆到编码此蛋白质的基因？七、分析题：1、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策?(2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带,其原因是什么？应该如何改进？2、燃料乙醇是目前研究的一个热点，运动发酵单胞菌能发酵六碳糖，但不能发酵五碳糖；大肠杆菌能发酵大部分碳源，但产乙醇的含量低。请设计一个在大肠杆菌中生产乙醇的技术路线，并用图例说明。（注:运动发酵单胞菌含有的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因）3、打算在细菌中表达一种稀有的药物蛋白质（来自人类基因)，以便能够大量制备这种蛋白.下图是编码该蛋白质的核苷酸序列。(1)请问这段cDNA序列要在大肠杆菌中表达应当还需考虑一些什么问题？（2)请选择一个合适的载体，试述该段cDNA序列克隆在载体中并导入大肠杆菌中表达的全过程?（3） 现为了确保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽分别加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同A蛋白柱结合,但很容易被EDTA溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。请你设计一对PCR引物，各含有10个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子（CAC）?另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码?4、我们实验室研究生做了一个如下的实验：将pdc基因（丙酮酸脱羧酶）克隆到pUC18载体中，以便在E。coli TOP10中表达，这个pdc基因两侧具有BamHI的位点,因此计划将它从BamHI的位点插入载体中。实验严格按分子克隆实验手册中进行:载体用BamHI切割后,立即用碱性磷酸酶处理，接着将处理过的载体同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4连接酶进行温育,连接后,将DNA同处理过的可以接受外源DNA的E。coli TOP10感受态细胞混合。最后将混合物涂布在加有氨苄青霉素、IPTG和x-gal固体培养基的平板上。实验中同时设置了4个对照：对照1：将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上。对照2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上.对照3：将经切割（但未用碱性磷酸酶处理)并用T4连接酶连接（但没有pdc基因）的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。对照4:将经切割(并用碱性磷酸酶处理过）并用T4连接酶连接(但没有pdc基因）的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落（见下表1）。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次,所有的平板上都没菌落生长（见下表1）。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(见下表1)。从实验平板上挑出12个菌落，分离质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体pUC18一样的单一的一条带,另3个克隆中切出一个pdc基因，实验终于获得成功。表1、pdc基因克隆的结果制备的样品实验结果第1次第2次第3次对照1 只有细胞TMTC00对照2 未切的载体TMTC01000对照3 省去磷酸酶处理，无pdc基因TMTC0435对照4 无pdc基因TMTC025实验样品TMTC034注:TMTC=too many to count，多到无法计数（1）你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么？（2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?（3)对照3和4各有什么作用？(4）为什么要用碱性磷酸酶处理载体？(5）pUC18表达的是pdc基因融合蛋白还是纯pdc基因产物?为什么？（6）第三次实验如何进行转化子的挑选？并说明其原理?基因工程原理习题集参考答案二、选择题参考答案1、B 2、B 3、C 4、C 5、B 6、C 7、B 8、C 9、B 10、C 11、C 12、C 13、D 14、B 15、C 16、D 17、B 18、C 19、B 20、D 21、D 三、填空题参考答案1、外显子,内含子,断裂基因; 2、必须基因,非必须基因； 3、转化,供体菌株，受体菌株; 4、变性、退火、延伸；5、碱性磷酸酶，5磷酸；6、质粒载体、噬菌体载体、人工染色体载体。7、200-500kb, 10-215kb，平均100kb;8、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺凝胶；9、切口平移法、随机引物法;10 GAATTC， GGATCC，GATC ；11、RNA酶，RNA；12、小于10kb,923kb；13、最快，最慢，居中。14、复制区，IG区.四、判断题参考答案：1、错误 2、错误 3、错误 4、错误五、说明题（下列各项在基因工程中的主要作用或功能)参考答案:1、电泳介质,用于分离大小相差1bp的DNA，或用于分离蛋白质。2、用于制备单链DNA,因载体有单链丝状噬菌体的IG区，在帮助单链噬菌体的帮助下在宿主细胞中制备单链DNA.3、补齐DNA5端缺失的磷酸4、用于植物基因工程的转化载体， 内含T-DNA区。5、DNA合成底物。6、电泳介质，用于分离大DNA或RNA7、作为分子杂交用，用于筛选与探针同源的基因8、除去DNA5端的磷酸基，防止DNA重组时载体的自连9、安慰诱导物，结构与别乳糖相似，用于诱导乳糖操纵元的表达10、生色剂，半乳糖苷酶分解Xgal形成蓝色产物,用于互补或蓝白斑筛选。六、问答题参考答案：1、分子标记是能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点的DNA片段。这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面具有非常重要的作用。分子标记的基础是个体间存在的自然遗传变异，进而造成许多遗传序列的多态性,即这些序列在不同的个体表现不同。分子标记就是通过查找和应用这种变异对个体、性状和基因在遗传差异的基础上进行鉴别.（1）限制性片段长度多态性这是发展最早的分子标记技术。其原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点发生变异的突变都可导致RFLP的产生。此技术包括以下基本步骤：DNA的提取和纯化；DNA的限制性内切酶酶切;用凝胶电泳将DNA片段分开;把DNA片段转移到滤膜上；利用放射性标记的探针与滤膜上的DNA片段进行杂交以显示特定的DNA片段，然后分析结果。(2）随机扩增多态性DNA该技术用随机引物非定点地扩增DNA片段,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分开扩增片段.其特点包括:不需DNA探针，设计引物也不需要预先知道序列信息；用一个引物就可扩增出许多片段，总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；技术简单，RAPD分析不涉及分子杂交、放射自显影或其他技术；RAPD分析所需DNA样品量少；RPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变.(3）扩增片段长度多态性其特点是把RFLP和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头）,用接头互补的但3/端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3/一端严格配对的片段才能得到扩增,再在有高分辨率的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染色法均可检测之.(4）单核苷酸多态性技术同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。目前SNP作为一种新的分子标记,已有2000多个标记定位于人类染色体上，在植物上也在进行开发研究。2、类限制性核酸内切酶、类限制性核酸内切酶和类限制性核酸内切酶三类.类限制性核酶最适合基因工程，因为类限制性核酶内切酶只由一条肽链构成，仅需MG2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA.类和类限制性核酸内切酶由于切割序列是随机的，与识别序列不统一,因此在基因工程中没有什么价值.3、细菌通过对自身DNA上的识别序列进行甲基化来保护自己的DNA不被限制性内切酶破坏。4、对于平末端DNA，右先连上工设计合成的EcoRI切割产生的脱氧寡核苷酸双链接头，然后再插入到EcoRI限制位点中去；也可以将EcoRI的限制位点进行改造,将粘性末端变成平末端后，用T4DNA连接酶进行连接。5、6、重组DNA的主要步骤主要包括以下四个基本步骤：（1)目的基因的获得；（2）目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体；(3）将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞,从而得到复制；（4）重组体分子的转化子克隆的选择和筛选。7、重组DNA的主要步骤主要包括以下四个基本步骤：（1)目的基因的获得;（2)目的基因与载体分子在体外进行连接反应,形成重组体;（3）将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制；（4）重组体分子的转化子克隆的选择和筛选。8、差异克隆：利用来源不同DNA之间的表现度差异来分离差异表达基因的功能克隆方法。在任何组织中都表达的基因是管家基因，在大多数cDNA文库中都出现.用一个来源的cDNA去除第二个来源中共同的RNA，留下独特的RNA用于文库构建。9、基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中,构成遗传物质的重新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达的过程.基因工程是基因分子水平上的遗传工程，是一门能定向改造生物遗传性状的育种新技术。基因工程能使带有各种遗传信息的DNA片段越过不同生物间特异的细胞界限而组入到完全不同的生物体内.定向地控制、修饰和改变生物体的遗传和变异，从而创造出自然界没有或具有新的遗传性状的生物新品种。10、（1)具有多克隆位点；(2）能自我复制;(3)具有筛选标记；(4)在细胞内的稳定性.11、 (1)具有多克隆位点；(2）能自我复制;（3）具有筛选标记;(4)在细胞内的稳定性。12、（1）cDDNA是指以m