微生物实验教学文案.doc

微生物实验

固定化细胞技术在废水处理中的应用
实验目的：学习固定化细胞技术的方法及意义。（琼脂包埋法、海藻酸钙包埋法）
实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果自己整理。问题与讨论（课堂布置）
微生物固定化方法中，以包埋法最为常用：包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。通过聚合作用或通过离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截留、凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄露，同时能让底物物质渗入进去和产物扩散出来。
包埋材料可分为天然高分子多糖类和合成高分子化合物两大类。
固定化微生物细胞的实用化对包埋载体的要求包括：
(1)固定化过程简单，易于制成各种形状，能在常温常压下固定化；
(2)成本低；(3)固定化过程中及固定化后对微生物无毒；
(4)基质通透性好；(5)固定化细胞密度大；
(6)载体内细胞漏出少，外面的细胞难以进入
(7)物理强度和化学稳定性好；(8)抗微生物分解：
(9)沉降分离性好。
在这些要求中，(1)和(2)涉及固定化细胞制备的成本；(3)－(6)针对固定化细胞的催化活性；而(7)－(9)则是出于对固定化细胞的操作稳定性的考虑。作为包埋载体，天然高分子多糖类的海藻酸钠和卡拉胶应用最多，它们具有固化、成形方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点。但它们抗微生物分解性能较差，机械强度较低。天然卡拉胶中含有l—卡拉胶，它使凝胶强度降低，除去l－卡拉胶所需的费用较高，而且凝胶对钠离子比较敏感。海藻酸钠凝胶在磷酸盐溶液中不稳定。这两种载体的凝胶虽然可用交联剂进行稳定化处理，但活力和传质性能又会下降。
合成高分子化合物中常用的载体物质有聚丙烯酰胺、光硬化树脂等。它们的突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定。但是聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。适用于细胞固定化的光硬化树脂聚合物一般尚未商品化，且固定化的操作条件也较严格。
一、 天然高分子多糖作为包埋材料
用于包埋固定化微生物细胞的天然高分子多糖包括：琼脂、海藻酸钙、卡拉胶等。在天然高分子多糖凝胶中网络形成的不同机理如图2－2所示。
图2 天然高分子多糖凝胶中网络形成的不同机理
细胞固定化技术（一）
——琼脂包埋法
1．琼脂包埋法
(1)原理
　在溶液中改变一个或多个参数，如改变温度、盐度、pH值或溶剂，一些天然或合成高分子聚合物，通过沉淀作用可以形成凝胶。
琼脂是一种天然高分子多糖，其结构示意图如图3所示。
琼脂凝胶截留细胞是一种非常简单易行的微生物细胞固定化方法。琼脂凝胶网络形成的模型如图4所示。凝胶网络的结构示意图如图5所示。
图3 琼脂的结构

图4 琼脂凝胶网络形成的模型

图5 琼脂凝胶网络的结构示意图
(2)固定化方法（实验中将采用方法I）
利用琼脂在温度高于50℃时熔化、而低于此温度时则凝固的特性，将其溶于水后与微生物混合，然后冷却凝固或滴入非水相溶液中，从而制成固定化微生物。其特点是包埋微生物活性较高，制作较容易。缺点是氧和底物及产物的扩散受到限制，琼脂凝胶的机械强度较差，且成球受温度影响较大。
以琼脂为载体，建立包埋固定化微生物细胞的方法如下。
方法I
①将琼脂加热溶于水，冷却至45—50℃；
②使琼脂溶液与微生物细胞混合均匀，琼脂的最终浓度为3％；
③将琼脂与微生物细胞的混合液倒入已灭菌的培养皿中，使之冷却凝固； ④将凝胶切成3mm×3mm×3mm的小方块，用生理盐水洗净，备用。
方法Ⅱ
①将琼脂加热溶于水，冷却至45—50℃；
②将琼脂溶液与微生物细胞混合均匀，琼脂的最终浓度为3％；
③在常温条件下(45—50℃)，将琼脂与微生物细胞混合物用针形管滴入上层是液体石蜡、下层是水的量筒中；
④滤出固定化细胞颗粒，用生理盐水洗净，备用。
方法Ⅲ
①将按方法Ⅱ制得的固定化细胞颗粒在下列溶液中浸泡30min；
　　　　　　ACAM 7.5％ 　BIS 0.4％
　　　　　　TEMED 0.5％ 　VC 　2.0％
②滤出固定化颗粒，加入到0.8％K2S2O4溶液中，在缓速搅拌下放置30min
③滤出固定化颗粒，用生理盐水洗净，备用。
采用上述三种不同的固定化方法包埋固定化微生物，其结果比较如表2—2所示。
表2　琼脂固定化方法的比较
固定化方法
方法Ⅰ
方法Ⅱ
方法Ⅲ
固定化细胞相对活性/%
38.4
32.1
25.0
由表2可以看出，用方法Ⅰ固定化微生物细胞的相对活性最高，而方法Ⅲ制备的固定化细胞相对活性最低。但方法I制备的固定化微生物细胞为块状，且强度较差。方法Ⅱ改善了固定化细胞的成型能力，制备出球形固定化颗粒。通过方法Ⅲ，在琼脂凝胶颗粒表面涂上一层聚丙烯酰胺膜，虽然增强了固定化细胞的机械强度，但固定化细胞的活性略有降低。
细胞固定化技术（二）
——海藻酸钙包埋法
2海藻酸钙包埋法
(1)原理
海藻酸钙包埋法是一种使用最广、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成型方便，对微生物毒性小，固定化细胞密度高等优点。海藻酸是用于包埋固定化微生物细胞的第一个聚合物。但足，当存在高浓度的K2+、Mg2+、磷酸盐以及其他单价金属离子时，海藻酸钙凝胶的结构会受到破坏。此外，由于海藻酸钙凝胶网络的孔隙尺寸太大，酶可能会从网络中泄露出来，因而，不适合于大多数酶的固定化。
海藻酸盐是棕色藻类的胞内产物，它由两种不向类型的单糖组成即1，4—β—D—甘露糖醛酸(M)和1，4—α—L—古洛糖醛酸(G)。海藻酸盐是一种共聚物，含有MM，GG，MG。甘露糖醛酸、古洛糠醛酸及其混合物组成海藻酸聚合物的结构如图6所示。

图6 由甘露糖醛酸（M）、古洛糖醛酸（G）
及其混合物组成海藻酸聚合物的结构
海藻酸盐中M／G的比值与海藻酸盐的来源有关。然而，商品出售的海藻酸盐一般没有产品的详细说明。所以，人多数以海藻酸盐为固定化载体材料的研究报告中没有说明其组成和结构。
海藻酸盐不能形成热可逆性凝胶，通常是在其钠盐溶液中加入二价离子、如Ca2+，通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络。凝胶的性质与引入的二价阳离子及海藻酸盐的类型(如M／G的比值)等有关。
二价阳离子对凝胶的机械强度有较大的影响，元素周期表中第二族金属离子与海藻酸盐形成的凝胶，其强度顺序如下：
Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞Mg2+
钙离子加入海藻酸钠镕浓中的方式对最终形成的海藻酸钙凝胶的性质影响很大。如果钙离子加入太快，则会导致局部凝胶化，形成不连续的凝胶结构。可以利用慢速溶解的钙盐来控制钙离子的加入速度。
利用海藻酸钙凝胶固定化微生物法安全、快速，制备简单，反应条件温和，成本低廉，且适用于大多数微生物细胞的固定化。海藻酸钙凝胶通常制成球形使用。

图7 钙离子诱导聚-L-古洛糖醛酸形成二聚体的模型
（参与螯合的氧原子以实心圆表示）
在海藻酸钙凝胶的形成过程中，钙离子优先与古洛糖醛酸(G)部分结合，如图7所示。
海藻酸钙网络的形成包括两个步骤：①最初形成二聚体；③钙离子诱导这些预先形成的二聚体，形成一个聚集体。其模型示意图如图8所示。
(2)固定化方法（实验中将采用方法I）
以海藻酸盐为载体，建立的包埋固定化微生物细胞的方法如下。
方法I
①将海藻酸钠加热溶于水，冷却；
②将海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2％－3％；
③将海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5％－10%CaCl2溶液中，放置2－4h。
④滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。
方法Ⅱ
①将按方法I制得的固定化细胞颗粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中搅拌1-2h；
②滤出颗粒，水洗后，用0.5％戊二醛交联5min；
③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。
方法Ⅲ
①将按方法Ⅰ制得的固定化细胞颗粒在下列溶液中浸泡80min：
ACAM 7.5％ 　BIS 0.4％
　　　TEMED 0.5％ 　VC 　2.0％
②滤出固定化颗粒，加入到0.8％K2S2O4溶液中，在缓速搅拌下放置30min
③滤出固定化颗粒，用生理盐水洗净，备用。
方法Ⅳ
①将按方法1制备的固定化细胞颗粒浸泡于下列溶液小：
　　壳聚糖 0.5％ CaCl2 0.2mol/L
　　　pH 6.0
②滤出颗粒，水洗后，用0.5％戊二醛交联5min；
②滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。
利用各种以海藻酸钙为包埋材料的固定化方法，包埋黑曲霉细胞，比较了各种固定化细胞的活性，其结果列于表3。
表3　海藻酸钙为包埋法的比较
固定化方法
方法Ⅰ
方法Ⅱ
方法Ⅲ
方法Ⅳ
固定化细胞相对活性/%
57.1
52.9
34.7
44.8
由表3可以看出，用海藻酸钙系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化细胞的活性较高。其中用方法I固定化细胞的活性最高，在方法Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中，由于在海藻酸钙凝胶表面涂上了一层高分子膜，虽然增强了固定化颗粒的机械强度，但同时加大了底物及氧的扩散阻力，从而降低了细胞的活性。此外，在方法Ⅱ、Ⅲ中所采用的戊二醛，丙烯酰胺单体等对细胞也有毒性作用。

图8 海藻酸钙网络形成的模型
细胞固定化技术（二）
——海藻酸钙包埋法
活性炭有极丰富的孔隙构造，具有良好的吸附特性，其粗糙的表面和较强的吸附特性，可以为微生物或者废水中的有机物提供寄存和富集的场所。活性炭投加后即与废水中的悬浮微生物结合形成生物活性炭(BAC)，有效地提高了对有机物的去除效果，此时水体中的有机物降解涉及到活性炭吸附，生物代谢和活性炭再生等。
活性炭：用自来水反复冲洗活性炭，然后于50℃-60℃的烘箱中烘12h，将颗粒状活性炭磨成粉末状。取出对数生长期的细菌20mL3份，命名为A,B,C，其中B,C分别投加0.4 g粉末活性炭，吸附固定24h。另取20mL不含光合细菌的培养液2份分别投加0.4 g粉末和0.4 g颗粒活性炭，命名为C,D，吸附24 h。将以上5份溶液各加入模拟废水200 mL，于27℃光照下培养，每隔一定时间测废水色度。
海藻酸钠+活性炭粉：称取海藻酸钠1.2g，活性炭粉1.5g，加人30ml水中，彻底溶解，加入菌体后，滴入2%CaCl2溶液中成球。，溶解时应待海藻酸钠溶解后再加入炭粉，否则无法确认海藻酸钠已全部溶解。