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恒温扩增技术综述

摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。

关键词：恒温扩增；PCR

引言：
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA） 和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。

1 滚环核酸扩增
1. 1 滚环核酸扩增的原理
滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针
的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA 可用于非环状DNA 的扩增，增倍数能达107 [2]。
1. 2 滚环核酸扩增的优势与不足
RCA 的优势：(1) 高灵敏度。RCA有很强的扩增能力，线性RCA 的效率可达到l05 倍，而指数RCA 的效率可达到109 倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单拷贝水平[3]；(2)高序列特异性。可以区分单一位点的不同模式；(3) 扩增产物经过磷酸化处理后可以直接用来测序。(4)高通量。RCA 可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA 产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增； RCA 只要保证探针的识别段序列与靶序列互补，不需要考虑靶序列的性质，因此检测RNA 时不再需要预先进行RNA 的逆转录。
RCA 的不足：（1）锁式探针常接近100bp， 合成费用较高。2000 年，Antson DO 等采用PCR 方法在实验室合成探针，可以在很大程度上降低成本；（2）信号检测时的背景问题。在RCA 反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA 或者RNA 可能产生一些背景信号。
1. 3 滚环核酸扩增在畜牧生产中的应用
虽然可以通过一些方法部分克服RCA 的不足，但也进一步增加了反应成本，使得RCA 在动物疾病的临床检测中不适合被采用。
2 环介导等温扩增
2. 1 环介导等温扩增的原理
环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA 在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4 种不同的特异性引物识别靶基因的6 个特定区域，在链置换型DNA 聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA 互补序列配对，启动链置换DNA合成[4]。
2. 2 环介导等温扩增的优势与不足
LAMP 的优势：（1）扩增效率高，能够在1h 内有效的扩增1-10 个拷贝的目的基因，扩增效率为普通PCR的10 倍-100 倍；（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。
LAMP 的不足：（1） 对引物的要求特别高；（2） 扩增产物不能用于克隆
测序，只能用于判断；（3）由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。
2. 3 环介导等温扩增技术在动物疾病检测中的应用
LAMP 技术从诞生之日起就被认为是最有可能代替PCR 进行实验室检测的方法。2008 年Anne-Lie B 等应用RT-LAMP建立了猪水疱病病毒(SVDV)的诊断方法[5]，该方法对血清样本的敏感性相当于实时PCR，对粪便样品的敏感性优于实时PCR。
3 链置换扩增
3. 1 链置换扩增的原理
链置换扩增其原理是基于在靶DNA 两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA 打开缺口，DNA 聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA 链[6]。被替换下来的DNA 单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。SDA 的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA 聚合酶、两对引物、dNTP 以及钙、镁离子和缓冲系统。
3. 2 链置换扩增技术的优势与不足
SDA 的优点：（1） 扩增效率高，据Walker 等人的报道，采用SDA 扩增结核分枝杆菌总DNA 中的一段序列时，37℃反应2 小时后，可将靶序列扩增106 倍[7]；（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。
SDA 的不足：（1）SDA 产物不均一。在SDA 循环中总要产生一些单、双链产物，用电泳法检测时必然要出现拖尾现象。（2）SDA 产物不可能直接用于克隆，测序和表达。使得SDA 在基因工程方面没有优势；（3）SDA 产物的检测手段有待提高。目前SDA 产物检测的主导方法是荧光偏振检测，但该检测方法需要特殊的检测仪器---- 荧光分光光度计，这限制了SDA 在临床的广泛应用。
3. 2 链置换扩增在动物疫病检测中的应用
当前SDA 方法主要应用于分枝杆菌核酸定性检测、病毒体外进化研究[23]和芯片杂交等方面，还没有运用于动物疫病的检测。
4 依赖核酸序列扩增
4. 1 依赖核酸序列扩增的原理
依赖核酸序列扩增(NASBA)是在PCR 基础上发展起来的一种新技术。是由1 对带有T7 启动子序列的引物引导的连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41℃进行，可在2 h 内将模板RNA 扩增109 倍[8]，比常规PCR 法高1000 倍。
4. 2 依赖核酸序列扩增的优势与不足
NASBA 技术的优势在于对RNA 病毒的检测，因为：（1）它的引物上带有T7 启动子序列，而外来双链DNA 无T7 启动子序列，不可能被扩增，因此在有DNA 污染的条件下，NASBA 技术同样具有较高的特异性和灵敏度[9]；（2）NASBA 将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。
NASBA 也存在许多缺陷：（1）反应成分比较复杂；（2） 需要3 种酶使得反应成本较高；（3）对DNA 病毒的检测上NASBA 就显得不是那么适合。
4. 3 依赖核酸序列扩增在动物疫病检测中的应用
NASBA 与LAMP 一样在恒温扩增技术中是相对成熟技术，现在已应用于动物疫病检测中。我国2004 年发布的8 项禽流感系列标准中，有两项应用了NASBA检测方法， 即GB／T19439-2004~H5 亚型禽流感病毒NASBA 检测方法》和GB／Tl9440-2004《禽流感病毒NASBA 检测方法》[10]。
6 小结
动物疫病的检测是一项特殊的检测工作，它一方面需要快速、准确的检测结果，另一方面对检测的成本也有着苛刻的要求。而恒温扩增技术在很大程度上符合了它的需要，虽然说当前把恒温扩增技术运用于动物疫病的检测还有着不少的缺陷，但它的优越性也是有目共睹的，特别是其中的LAMP 和NASBA 已经逐渐开始运用到动物疫病的检测中。我们相信通过对恒温扩增技术的不断完善，它必然会和PCR 技术一样成为动物疫病检测中不可缺少的检测手段。
【参考文献】
[1] Hobbie J E，Daley R J, and JasperS. Use of nuclepore filters for countingbacteria by fluorescence microscopy[J].Appl Envir Microbiol，1977，33 (5)：1225-1228
[2] 李影，王伟利，钱爱东. 畜产中相关食源性致病菌“活的非可培养状态”的检测策略[J].中国动物检疫，2009，26(1)：46-47
[3] Wu HC, Shieh J , W righ t DJ , etal. DNA sequencing using rolling circleamplification and precision glass syringesin a high-through put liquidhandlingsystem[J ]. Bio techniques, 2003,34 (1) : 2042207
[4]孙晓媛，钱爱东，李影. 三株沙门氏菌VBNC 状态诱导条件的筛选[J]. 中国预防兽医学报，2009，31(1)：193-197
[5] Demidov VV. Rolling-circle amplificationin DNA diagnostics: thepower of simplicity [J]. Expert RevMol Diagn, 2002, 2(6): 542-548
[6] Antson DO, lsaksson A, LandegrenU, et a1.PCR-generated padlockprobes detect single nucleotide variationin genomic DNA [J]. Nucl AcidRes. 2000, 28(12): 58
[7]王明俊等.兽医生物制品学［M］. 北京：中国农业出版社，1995
[8]孙濯华.中国高新技术产业导报［J］，1997,6
[9]姜源等.医学生物技术［M］.北京：人民卫生出版社，1996
[10]刘建忠，李宁，熊远等.生物技术通报，1997