蛋白表达纯化实验步骤.doc

蛋白表达纯化实验步骤（待改进)
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA.
2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒.
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、
Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。6左右，加入IPTG,浓度梯度从25μM
到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达）。
2)SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体
蛋白的50％以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带.
3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围.
甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30％—60％，使用时自己计算用量.
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速(140-180rpm），
诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2.
保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融.
8、包涵体检测。方案见附件2
9、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1。5，约5h左右，视菌种
的活性而异,也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约
2。5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当
的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。
3）过夜摇菌,使用包涵体检测的温度（18°左右)，转速140rpm左右.
4）将菌液6000rpm,4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓
冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是,离心管要重复使用，用完后洗净保存。
10、超声波裂解.
1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作，7s休息，50min即可.
注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡.
4.正常声音为:孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头
松动等原因,要及时调整.溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关）。
注意：1。如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解
60分钟，60分钟足够裂解.
11、取得上清
1)将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm,15min,4°离心.沉淀为包涵
体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7。5左右。平衡buffer的pH是7。8左右，裂解后上清就会在7.5左右.）
12、纯化上清—-—摸洗脱条件。
1)镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。（若是流
速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。)取20μl过柱后的样品，以备跑胶。
3)分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别
的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶.
注意:理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零,怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了.
4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4。5ml(将前面的0.5ml单独接入EP
管,再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。
5)加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O.流完后保存于2
倍体积的20％乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。(尿素可能对NI柱有损伤.）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7。8 ，上清pH=7。5 ，Wash Buffer pH=7。0 ，Elution Buffer pH=7.2.
13、跑胶验证。
1）跑2块0。75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相
同两块胶才会比较一致。
2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、
W7、W8、W9、E1、E2、MES
3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右.(也可以300V,30min,只是
图没有160V好看。）
4）考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。
5)脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。
14、纯化上清——-收集目的蛋白
1)将重生的镍柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。
2）重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。
15、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。
16、透析.
1)配制2L透析液(配方见附件1)，并放于—20度冰箱预冷但不要结冰。
2)透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净。
3)用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其
中,置入提前预冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1。5h后换液。透析3次即可.
注意：用广口瓶装透析液,将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。
17、浓缩。
1)将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。
2)30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。
3)每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4）透析袋用完后，洗净，保存于20％乙醇中4°存放。
注意:浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1—2ml体积.用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存.
18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步.
1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。
2)配平。
3)7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右.浓缩4倍。可根据需要选择
不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩.
4）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心.重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋
白储存液.蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl
溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油(1%-5%即可）助溶。
5）收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白
浓度(测量后)，制备日期。
注:超滤管的使用方法见附件4
19、蛋白浓度测定.见附件3
20、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。
21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状.
22、注射兔子.选择合适的注射方式和合适的免疫程序。
23、收集免疫血清.提取抗体。
24、抗体效价评定。
附件1
所需溶液配方:
1）20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7。4
试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4—12H2O NaCl
用量(g）1L 0。5928 5.802192 17。532
2）Equilibration Buffer(平衡缓冲液): PBS with 10 mM 咪唑pH 7.4
3)Wash Buffer（清洗缓冲液)： PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH 7。4
4）Elution Buffer（洗脱缓冲液)： PBS with 250 mM 咪唑pH 7.4
5）MES(再生缓冲液）: 20 mM 2-（N—morpholine）-ethanesulfonic acid, 0。1 M sodium
chloride; pH 5。0。即0。3904g MES+0.5844g NaCl。
6)透析袋处理液: 2%（w/v）碳酸氢钠和 1 mmol/L （pH8。0） EDTA
7）透析液：20mM PBS+50 mM NaCl（2。92g）
试剂名称NaH2PO4—2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl
用量（g）1L 0。5928 5。802192 2。92g
TIPS:1—4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS，用500ml水将
试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。最后,定容。Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml,Equilibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml.
附件2
包涵体检测
1。摇10ml菌，加0.5％葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0。5后离心加入新的培养基和相
应浓度的IPTG低温(16—25度)诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）。在离心前取500μl菌液作为负对照,诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解,直接煮沸10min跑胶。
2。诱导完成后,用2ml EP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。1.5ml PBS （50m M
PBS,300m M NaCl )重悬细菌。
3.裂解细胞。用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。裂解3s,停止6s，
裂解时冰上放置.
4。分离上清。5000rpm，4min,4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm，
10min，4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中,加5微5*SDS loading buffer混匀，煮沸10min.
5。重悬包涵体。用1000微PBS震荡重悬包涵体,取20微于200微的EP管中加5微
5＊SDSloading buffer，煮沸10min。
6。正负对照的收集.离心收集正负对照菌体,0。5ml上清留下40μl,加入10μl5＊SDSloading
buffer，煮沸10min裂解。
7。跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: -，+,上清，包涵体.
附件3
蛋白浓度定量测试方案
1.将染色剂稀释.
稀释5倍,取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2O。充分溶解后用0.44μm 的滤膜过滤于另50ml离心管中.（此剂量可测4个样品。）
2。牛血清白蛋白(BSA）标准品的制备
1）将冻干的BSA溶于去离子水中,溶解成浓度为1mg/ml,分装为400—500μl/支（可以
室温放置60天，-20度长期保存)。
2)将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0。6、0。8mg/ml,各180μl，另外加一管水为
3.染色。
1)取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1。5mlEP管中.4个
梯度各做一个重复,共8支，另外加1个样品(或1+n个样品）和1个blank，共10支EP管（或10+n支)，分别对应标记。
2）将30μl样品和30μl标准BSA及30μl H2O分别加入上述EP管中。涡旋混匀.
3）室温孵育5min到60min。5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好,因为Absorbance wil increase over time。
4。 吸光度的测量。600nm处测量,并记录吸光度.注意：1. blank是染色液加30微升的水。
2。从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围,据此决定sample 的测量顺序.
5. 比色皿的洗涤。用100%乙醇浸泡洗涤.
6。 标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线.
附件4。
4ml millipore超滤离心管使用注意事项
1。用前用miliq 水润湿。
2。4度预冷。
3。离心力不能超过7500g。加速度设定为8。
4。离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心,以使两膜所受的压力一
致。
5.使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h,后加入1ml20%乙醇保存。
如果要短期保存几天,也可加水浸泡。
附件5
聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法
附件6。
包涵体蛋白的提纯
与提上清中所用试剂不同之处:在Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer 中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白.在裂解完后,离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中都含有6M尿素或盐酸胍。另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶.这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶.
如果要做包涵体,建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去,除去后蛋白可能就析出了。尿素毒性相对较小，可以不用除去。这样可以省去很多麻烦。尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解:6mm变幅杆,15%功率， 3s/6s，10min左右即可。也可以加上1%-—-5%的甘油助溶。甘油是加在Equilibration Buffer 中的。
另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌,无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0。6左右。
乙醇法淀蛋白跑SDS—PAGE
1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl 100%乙醇,乙醇要-20度预冷，涡旋。
2、—20度放置10min。4度,15000rpm,10min,小心弃去上清，尽量去干净。此时管底可
见蛋白沉淀。
3、向管中加30μl 1.5＊SDS—loading buffer。（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。
4、上样,跑胶。
如有错误，敬请批评指正.
血清的提取
动物血采集后,室温自然凝固后立即4500g，10min离心,分离出血清。
抗血清保存有三种方法:
第一种是4℃保存，通常可保存3个月~半年，效价高时可保存一年左右; 第二种是—20℃～—40℃低温保存,可保存5年左右，但需防止反复冻融；
第三种是真空冰冻干燥保存,可保存5～10年.
注：耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会溶血。