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甜瓜多种真菌病害拮抗细菌NBmelon-1的鉴定及其促生和生防效果

郝芳敏 臧全宇 马二磊 丁伟红 王毓洪 黄芸萍

摘    要：从甜瓜根部分离纯化获得一株多粘类芽孢杆菌NBmelon-1，探究其对甜瓜及甜瓜病害的影响。采用平板对峙法对拮抗菌株筛选鉴定，发现对甜瓜多种真菌病害的病原菌均有抑制作用，例如尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum）、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）、蔓枯病菌（Didymalla bryoniae）、层生镰刀菌（F. proliferatum）、亚洲镰刀菌（F. asiaticum）和链格孢（Alternaria alternata）等;采用苗期灌根的方法，发现NBmelon-1对甜瓜幼苗的生长具有促生作用，甜瓜幼苗的茎粗、叶片大小、鲜质量与对照相比均有显著提高;盆栽实验表明，其对甜瓜枯萎病具有良好的生防潜力，相对防治效果为52.76%，可很好地防治甜瓜枯萎病。
关键词：甜瓜;多粘类芽孢杆菌;NBmelon-1;甜瓜枯萎病;生防潜力
：S652    文献标志码：A   ：1673-2871（2021）07-014-06
Identification， biocontrol and growth promoting effects of antagonistic bacteria NBmelon-1 of various fungal diseases in melon
HAO Fangmin， ZANG Quanyu， MA Erlei， DING Weihong， WANG Yuhong， HUANG Yunping
（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China）
Abstract： In this study， a strain of Paenibacillus polymyxa NBmelon-1 was isolated and purified from the diseased roots of melon， which has good inhibitory effect on the pathogen of various fungal diseases of melon， such as Fusarium oxysporum， Monosporascus cannonballus， Didymalla Bryoniae， F. proliferatum， F. asiaticum and Alternaria alternata， and showed strong antagonistic activity on the plate. Furthermore， NBmelon-1 could promote the growth of melon seedlings， and significantly increased the stem diameter， leaf size and fresh weight of melon seedlings compared with the control. In addition， pot experiment also showed that it had biocontrol potential to control the melon fusarium wilt， and the relative control effect was 52.76%.
Key words： Melon; Paenibacillus polymyxa; NBmelon-1; Fusarium wilt; Biocontrol potential
甜瓜（Cucumis melo）是我国重要的经济作物、传统的夏食水果之一，属于葫芦科黄瓜属甜瓜种，是一年生草本植物[1]。但是在设施栽培中，甜瓜病害一直是生产上的难题，特别是尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌（Fusarium oxysporum）引起的甜瓜枯萎病[2]、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）引起的甜瓜黑点根腐病[3]、蔓枯病菌（Didymalla bryoniae）引起的甜瓜蔓枯病[4]、亚洲镰刀菌（F. asiaticum）引起的甜瓜果腐病[5]、层生镰刀菌（F. proliferatum）引起的甜瓜根茎腐[6]及链格孢菌（Alternaria alternata）引起的甜瓜叶斑病[7]等。目前对于大棚甜瓜病害的防治，主要依赖于化学防治方法，但是长期使用农药，病原菌会产生耐药性，以及造成环境污染和农药残留等问题。因此需要一些对环境更为友好的替代防治措施，而生物防治就是其中之一。
多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一种革兰氏阳性菌，一类对植物根部有益的细菌，对植物的生防和促生都有一定的作用[8]。近年来，关于多粘类芽孢杆菌用于植物生防和和促生方面的报道很多，例如王波等[9]从大豆中分离的一株内生多粘类芽孢杆菌，对甘薯黑斑病具有很好的防治效果（达73.62%），显著地抑制其分生孢子的萌发。张忠良等[10]从黄瓜分离的多粘类芽孢杆菌K18-5对黄瓜枯萎病有67.45%的防治效果;而且對黄瓜植株具有一定的促生作用，提高了叶绿素含量和根系活力;此外还能有效抑制黄瓜根际基质中细菌和放线菌数量。祝久香[11]分离的多粘类芽孢杆菌HX-140可分泌蛋白酶、纤维素酶、β-1-3-葡聚糖酶和挥发性抑菌气体，对黄瓜枯萎病有55.56%的防病效果。
笔者在分离甜瓜根部病害时分离到一株多粘类芽孢杆菌NBmelon-1，对甜瓜多种病原菌均有抑制作用，平板拮抗活性很强，于是进一步测定了NBmelon-1对甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病防治效果，以期为甜瓜病害生防菌剂的开发应用奠定基础，为甜瓜病害的绿色防控提供技术保障。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和培养基
供试病原菌：有尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F. oxysporum）TG-5、层生镰刀菌（F. proliferatum）Fp-1、黑点根腐病菌（M. cannonballus）Mc-30、蔓枯病菌（D. bryoniae）MF-17和链格孢（A. alternata）Aa-1等5种，均由笔者实验室分离获得，在PDA培养基上进行活化，作为供试菌株。细菌NBmelon-1，在发病的甜瓜根部上分离获得，采用NA培养基培养。供试甜瓜品种为厚皮甜瓜甬甜5号，由宁波市农业科学研究院提供。所有试验在宁波市农业科学研究院瓜菜重点实验室和宁波市高新农业技术实验园区完成，田间实验于2020年9月完成。
NA培养基：牛肉浸膏 10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL，pH 7.0。
NB培养基：牛肉浸膏 10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL，pH 7.0。
PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL。
1.2 NBmelon-1的分子鉴定及系统发育树的构建
对拮抗细菌的分子鉴定，采用50 μL的PCR反应体系进行16S rDNA的扩增、测序及系统发育进化分析。拮抗细菌的基因组DNA用全式金细菌基因组试剂盒提取（EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit）。扩增菌株的16S rDNA，采用细菌通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行扩增[12]，扩增的PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测，对阳性PCR产物进行纯化、克隆和测序[13]。
将测得的16S rDNA序列在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行核酸比对，利用软件MEGA7.0[14]进行系统进化树的构建，明确拮抗菌的分类地位。
1.3 NBmelon-1对不同病原菌的平板拮抗作用
采用平板对峙法进行防病拮抗菌株的筛选，在PDA培养基上活化尖孢镰刀菌甜瓜专化型菌株TG-5、层生镰刀菌菌株Fp-1、黑点根腐病菌菌株MC-30、蔓枯病菌菌株MF-17和链格孢菌菌株Aa-1等5种病原菌，用直径5 mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，挑取新鲜菌丝块接种在距新的PDA平板一端1.5 cm处，用接种环挑取少量新鲜NBmelon-1菌液，于PDA培养基的另一端划线，划线处距PDA端部距离为2 cm，封口膜封好后置于25 ℃培养箱中黑暗培养，10 d之后统计试验结果，每个菌株3个皿，对照只接病原菌，不接NBmelon-1[15]。
1.4 甜瓜种子发芽率的促生试验
将上述拮抗细菌接种到NB培养基中，在摇床上摇培24 h，配置成拮抗细菌悬浮液。挑取健康饱满的甜瓜种子，用50 ℃温水进行浸种30 min，待冷却后分别浸在拮抗细菌的悬浮液中2 h，用NB作对照，每个处理100粒种子，3次重复，用拧干水的干净毛巾包好，置于30 ℃条件下催芽36 h，调查发芽率[16]，采用t测验（p < 0.01）分析差异显著性。
1.5 甜瓜幼苗的促生试验
在温室大棚中，利用盆栽试验进行拮抗细菌对甜瓜幼苗的促生试验，在甜瓜种子播种7 d和9 d后，用移液器将拮抗细菌配置的108 cfu·mL-1悬浮液对甜瓜幼苗进行灌根，每株幼苗用1 mL菌液处理，共计150株，NB培养基处理做对照。15 d后，拔出完整的甜瓜幼苗，每个处理取30株幼苗，只保留地上部分，测量幼苗的茎粗，每株幼苗中最大一片真叶的长、宽及鲜质量，统计分析数据[17] ，采用t测验（p < 0.01）分析差异显著性。
1.6 对甜瓜枯萎病的盆栽生防作用
试验分为空白对照CK和处理。
NBmelon-1处理：在甜瓜播种7 d、9 d，用108 cfu·mL-1的NBmelon1菌悬液对甜瓜幼苗进行灌根，每棵幼苗用1 mL菌液处理。每个处理1个穴盘，每穴盘50株，设3次重复。
甜瓜枯萎病接种：甜瓜品种为对甜瓜枯萎病感病品种，在2叶1心时，以50株幼苗为1组，3次重复，左边一半接种，右边一半不接种。将幼苗从穴盘中取出，轻度损伤根系，洗净根部，在4×106个·mL-1的枯萎病菌孢子液中浸根15 min，根系全部浸入，中间摇动2次，不接种的在清水中浸根15 min。再移栽至营养土中，接种后前3 d遮阴，温度保持在25 ℃，3 d缓苗后撤掉遮阳网，在温室正常管理，15 d后调查发病情况[18]。鉴定标准：整株无病症为0级;晴天中午子叶萎蔫或部分子叶、 真叶轻微萎蔫为1级1片真叶萎蔫或子叶较重萎蔫为2级;子叶及真叶萎蔫， 阻碍发育为3级;整株萎蒸，60%以上枯死， 心叶成活为4级;整株严重萎蔫并枯死为5级[19]。病情指数=∑（级数×该级株数）/（总株数×最高级数）×100，相对防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。
2 结果与分析
2.1 NBmelon-1的的分子鉴定及系统发育树分析
以菌株NBmelon-1的基因組DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物1492r/27f进行PCR扩增，经连接、转化、测序后，序列为1517 bp，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果表明与菌株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）YC0136（ITS，GenBank Acc. CP017967.3）的同源性最高，为99.54%。利用MEGA7对测序获得的序列和其他相近的序列进行系统发育树构建，结果表明，菌株NBmelon-1与菌株聚为一支（图1），所以认为NBmelon-1属于多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）。
2.2 NBmelon-1对不同病原菌的平板拮抗作用
利用平板对峙法进行NBmelon-1对不同病原菌的平板拮抗试验，在对峙培养10 d后，可以看到NBmelon-1对尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F. oxysporum）TG-5、层生镰刀菌（F. proliferatum）Fp-1、黑点根腐病菌（M. cannonballus）MC-30、蔓枯病菌（D. bryoniae）MF-17和链格孢（A. alternata）Aa-1等病原菌的生长均有一定的抑制作用，在对峙培养过程中，培养皿中均出现了明显的拮抗带，后期对峙的病原菌也无法再生长（图2）。
2.3 甜瓜种子发芽率的促生试验
用NBmelon-1的菌悬液处理的甜瓜种子，在催芽36 h后，发芽率为92%，与对照的90%无明显差异，但是NBmelon-1处理的种子胚芽的长度为13 mm，相对于对照胚芽的19.3 mm明显降低，表明NBmelon-1对种子出芽率无明显差别，但是可抑制胚芽的生长（图3）。
2.4 甜瓜幼苗的促生试验
在甜瓜种子播下7 d和9 d，用NBmelon-1的菌悬液在甜瓜根部进行灌根，每次灌根1 mL，在15 d时，对甜瓜幼苗的地上部分进行测量统计，可以看到用NBmelon-1菌悬液处理的甜瓜幼苗，在茎粗、鲜质量及最大一片真叶的长和宽，都有显著升高，表明NBmelon-1对甜瓜幼苗有一定的促生作用（图4）。
2.5 对甜瓜枯萎病的盆栽生防作用
在甜瓜枯萎病菌接种15 d后进行调查统计，用NBmelon-1预处理的甜瓜病情指数为45，而对照的病情指数为95.26（图5），用NBmelon-1预处理相对防治效果为52.76%（表1），表明NBmelon-1对甜瓜枯萎病具有一定的生防作用。
3 讨论与结论
尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌（Fusarium oxysporum）引起的甜瓜枯萎病、黑点根腐病菌（M. cannonballus）引起的甜瓜黑点根腐病、蔓枯病菌（D. bryoniae）引起的甜瓜蔓枯病、亚洲镰刀菌（F. asiaticum）引起的甜瓜果腐病、层生镰刀菌（F. proliferatum）引起的甜瓜根茎腐、链格孢菌（A. alternata）引起的甜瓜叶斑病、茄病镰刀菌（F. solani）引起的甜瓜根腐病[2-7， 20]等真菌病害，制约着甜瓜的健康生长，严重时造成毁灭性的损失，而随着甜瓜病害绿色防控技术生产体系的提出和完善，甜瓜生物防治受到各方面的关注。
陆淼等[21]报道哈茨木霉菌可明显抑制甜瓜蔓枯病病原菌的生长，而且对甜瓜幼苗的生长具有明显的促生作用。汪军等[22]报道枯草芽孢杆菌在田间对甜瓜白粉病具有很好的防效，对甜瓜植株的生长和果实糖度的积累都有很好的促进作用。王雅雅等[23]报道解淀粉芽孢杆菌对甜瓜叶枯病病原菌具有高效拮抗作用，通过盆栽试验发现对甜瓜叶枯病具有很好的生防潜力。吴丽媛[24]报道枯草芽孢杆菌BW-6对甜瓜细菌性果斑病具有80.3%的防效，可在甜瓜叶面上大量定殖。邹立飞等[25]报道甲基营养型芽孢杆菌对甜瓜枯萎病的防治效果较好和对甜瓜种子发芽率的提高具有促進作用。王杏芹等[26]报道多粘类芽孢杆菌G-14对3种甜瓜细菌性病原菌具有明显的拮抗作用。
笔者对发病甜瓜根部分离的拮抗细菌NBmelon-1，基于16S rDNA序列进行系统进化树分析，鉴定为多粘类芽孢杆菌。NBmelon-1不仅可以促进甜瓜幼苗的生长，而且对甜瓜枯萎病、甜瓜黑点根腐病、甜瓜蔓枯病、甜瓜果腐病等真菌病害具有很强的拮抗活性。在盆栽实验中对甜瓜枯萎病具有很好的生防效果，为甜瓜枯萎病的防治探索了一条可能的生物防治途径。目前，还未在田间进行试验，有待进一步验证拮抗细菌NBmelon-1的生防效果，但为开发微生物菌剂提供了很好的基础。
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