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染色体步移步骤

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染色体步移技术（Genome Walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：  
1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；
2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；
3. 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；
4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；
5. 用于人工染色体 PAC、YAC 和 BAC 的片段搭接。
其主要原理是根据
已知 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP  Primer），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称 PCR 反应。
现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍的很详尽，下面给你发一个原理图：

大致的原理是这样的，依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下：

1. 基因组 DNA 的获取。
基因组 DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因
组 DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组
DNA。此外，由于本方法灵敏度极高，模板 DNA 一定不要污染，所需的 DNA 量不要少于 3 μg。
2. 已知序列的验证。
在进行 PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序
列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产物进行测
序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。
3. 特异性引物的设计。
根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。
4. 1st PCR 反应。
基因组 DNA 经 OD 测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应 DNA 量并不相同，实际
用量参考下面的注*1），以 AP  Primer（四种中的任意一种，以下以 AP1  Primer 为例）作为上游引
物，SP1 Primer 为下游引物，进行 1st PCR 反应。
①   按下列组份配制 1st PCR反应液。
Template（基因组 DNA）  x  ng *1                   
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ）  8  μl             
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus）                5  μl
TaKaRa LA Taq ®（5 U/μl）                0.5  μl
AP1 Primer（100 pmol/μl）                   1  μl
SP1 Primer（10 pmol/μl）                      1  μl
dH2O                                  up to 50  μl

②  1st PCR 反应条件如下：
94℃         1 min      
98℃           1 min      
94℃         30 sec      
60~68℃*2 1 min           5 Cycles
72℃         2~4 min*3   
94℃         30 sec；  25℃         3 min；  72℃      2~4 min*3       
94℃         30 sec；  60~68℃*2    1 min；  72℃      2~4 min*3
94℃         30 sec；  60~68℃*2    1 min；  72℃      2~4 min*3       15 Cycles
94℃         30 sec；  44℃         1 min；  72℃      2~4 min*3
72℃         10 min     
 5. 2nd PCR 反应。
将 1st PCR反应液稀释 1~1000 倍后，取 1  μl作为 2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引
物，SP2 Primer为下游引物，进行 2nd
PCR反应。
① 按下列组份配制 2nd PCR反应液。
Template（1st PCR反应液）     1  μl *4                  
dNTP Mixture（2.5 mΜ each )                8   μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus）               5  μl
TaKaRa LA Taq ®（5 U/μl）                  0.5  μl
AP1 Primer（100 pmol/μl）                   1  μl
SP2 Primer（10 pmol/μl）                  1   μl    
dH2O                                  up to 50  μl 
②  2nd PCR 反应条件如下：

94℃       30 sec；      60~68℃        1 min*2；   72℃    2~4 min*3
94℃       30 sec；      60~68℃        1 min*2；   72℃    2~4 min*3     15 Cycles
94℃       30 sec；      44℃         1 min   ；      72℃    2~4 min*3
72℃       10 min    

6. 3rd PCR 反应。
将 2nd PCR反应液稀释 1~1000 倍后，取 1  μl作为 3rd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引
物，SP3 Primer为下游引物，进行 3rd
PCR反应。
① 按下列组份配制 3rd PCR反应液。 
Template（2nd PCR 反应液）          1  μl *4                   
dNTP Mixture（2.5 mΜ each )                    8  μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus）                    5  μl
TaKaRa LA Taq ®（5 U/μl）                   0.5  μl
AP1 Primer（100 pmol/μl）                      1  μl
SP3 Primer（10 pmol/μl）                   1  μl    
dH2O                                     up to 50  μl

②  3rd PCR 反应条件如下：

94℃       30 sec；      60~68℃*2    1 min；     72℃    2~4 min*3
94℃       30 sec；      60~68℃*2    1 min；     72℃    2~4 min*3     15 Cycles
94℃       30 sec；      44℃         1 min；     72℃    2~4 min*3
72℃       10 min       

7. 取 1st，2nd，3rd
PCR反应液各 5 μl，使用 1％的琼脂糖凝胶进行电泳。
8. 切胶回收清晰的电泳条带，以 SP3 Primer 为引物对 PCR 产物进行 DNA 测序。 
染色体步移的注意事项

CTAB提取DNA

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