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蛋白相互作用Pull-Down实验

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蛋白相互作用Pull-Down实验

实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。

实验准备：

实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、
实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液
实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KCl
SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT

裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））
实验方法：
方法一：
1、 预清除细胞裂解液：
将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。
离心机12,000g在4℃离心2min。
将上清转移至新的离心管中。
2、 探测细胞裂解液
两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
最大速度在4℃离心样品2min。
在新的微量离心管中收集上清。
用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。重复洗三次。
加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。
将洗脱蛋白质与等体积的2×SDS-PAGE上样buffer混合。
3、检测相互作用蛋白质
将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

方法二：
1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在4℃孵育结合30min。
2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃作用4h。
3、3000rpm在4℃离心5min，除去上清。
4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复5次。
5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。

方法三：
实验试剂：PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）
Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM还原型谷胱甘肽
0.154g溶解到50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制Elution Buffer。
1、 细胞裂解
取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育20-30min。
2、固定GST融合蛋白到柱子上
将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。重复洗3次以上。
平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。加200ul含GST融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min
小心移去上清，（保存以便分析，）将250ul Binding Buffer或wash Buffer加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer或Washing Buffer再次清洗，将凝胶用20ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。
3、 捕获猎物蛋白
将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ul Binding Buffer或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转孵育1h。移去上清。
将400ul Binding Buffer或wash Buffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min，移去上清。加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。小心移去上清。
分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer，在室温下混合5min。取出上清用于分析。

His Pull-Down方法
实验试剂：
Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑
Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM咪唑
实验步骤：
1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤，
2、与Ni-NTA树脂（1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂）4℃混合孵育3h。
3、待树脂沉淀后用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。
4、用6倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。
5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。
6、SDS-PAGE电泳分析
7、纯化的蛋白与Ni-NTA树脂冰浴作用2h，
8、10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，
9、然后加入过量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h，
10、用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，
11、加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，
12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。
13、阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，

注意事项：
1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。
2、平衡柱子：
2.1 用3-5个柱体积蒸馏水洗柱
2.2 用3-5个柱体积的binding buffer平衡柱子。
3、洗柱：
如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质
3.1 除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积的PBS洗柱
3.2 除去疏水性物质，用3-4个柱体积的70%乙醇或2个柱体积的含1%Triton X-100的PBS洗柱，然后用5个柱体积的PBS洗柱
4、柱子的保存
用3-5个柱体积的超纯水洗柱后，用3-5个柱体积20%的乙醇洗柱后将柱子保存于4℃冰箱
5、Ni离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带His标签融合蛋白纯化的步骤。

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