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1、此文档收集于网络，如有侵权请联系网站删除 学校代码： 10023 学 号：$2012010013 硕士学位论文 新型ABCA 1、SR．BI／CLA．1表达上调剂的 抗动脉粥样硬化活性及其作用靶标发现研究 所 院： 医药生物技术研究所 姓 名： 王潇 指导教师： 司书毅教授 导师小组： 司书毅教授许艳妮副研究员 学科专业： 微生物与生化药学 研究方向： 心血管药理学 完成日期： 201 5年5月
2、 万方数据 此文档仅供学习和交流 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示
3、谢意。 学位论文作者签名：孑溺‘ 签字吼矽J岁年石月弓．日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j壁塞迹塑医堂陵有关保存、使用学位论文的 管理办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权j量塞迹塑医堂院可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 一．呓 ．詹 学位论文作者签名： 叱7荫、 导师签名： 和L 签字日期： 渺年 易月≥日 签字日期：沙疗r年 6月了 日
4、 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 万方数据 目录 中文摘要 ．1 ABSTRACT ．．3 前言日!J舌 88 实验材料 11 实验方法 17 实验结果 33 讨{仑 ．52 结论 ．55
5、参考文献 56 文献综述 61 发表论文及参加会议 70 致{射 ．72 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 心血管疾病在发达国家和大多数发展中国家是危害人类健康的主要杀手，而动 脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多种严重心血管疾病的
6、病理基础。AS的病理生 理过程主要是血管内皮细胞的受损以及巨噬细胞、血管平滑肌细胞在血管壁的沉积 形成泡沫细胞，从而使动脉血管壁不断加厚，最终引起动脉粥样硬化。ATP结合盒 转运体A1(ATP．binding cassette transporter A1，ABCAl)和清道夫受体B型I (scavenger receptor class B type I，SR．BI)是介导胆固醇逆转运的关键蛋白，在机体 清除多余脂质的过程中发挥着重要功能。人的高密度脂蛋白受体被称作CLA一1。 ABCAl和SR．BI／CLA．1被认为是预防或治疗动脉粥样硬化的潜在靶标。 实验室前期在已有的ABCA
7、l、CLA．1表达上调剂筛选模型上得到了活性化合 物吴茱萸次碱(Rutaecarpine，RUT)，进一步研究发现RUT在体内能通过上调 ABCAl、SR-BI起到抗AS的作用。RUT是瞬时受体电位香草醛亚家族1(Transient Receptor Potemialcation channel subfamily V memberl，TⅪ'V1)的激动剂。近些年有 研究表明，TRPVl与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病有着密切的关系。Ma等 的研究结果表明，激活TRPVl能够上调ABCAl的表达，减缓AS的发生发展。因 此，TRPVl可能是位于ABCAl、SR-BI／CLA．1上游的作用靶标
8、 鉴于ABCAl、SR—BI／CLA—l在动脉粥样硬化发生发展以及治疗中的重要作用， 我们进行f ABCAl、SR—BI／CLA．1表达上调剂的抗动脉粥样硬化活性研究，及其 上游作用靶标发现的机制研究。 1．ABCAl、CLA．1表达上调剂的发现 本论文首先以实验室前期构建的ABCAl和CLA—l表达上调剂筛选模型为基础， 进行了大规模的化合物筛选，以期发现能够提高ABCAl、CLA一1表达水平的活性 化合物。应用此模型对化合物库中的化合物进行了筛选，发现了活性化合物E0869； 针对合成的RUT衍生物进行了筛选，获得了活性化合物R20。 2．E0869体外抗动脉粥样
9、硬化活性研究 Western blot和RT-PCR实验表明，活性化合物E0869能上调肝细胞HepG2中 ABCAl、CLA．1以及ABCGl的mRNA以及蛋白水平，但不影响FAS、SREBP—lc 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文
10、 中文摘要 的表达。E0869能上调巨噬细胞RAW264．7中ABCAl、SR．BI以及ABCGl的mRNA 以及蛋白水平，但不影响CD36的表达。巨噬细胞泡沫化实验表明，E0869能使泡 沫化巨噬细胞RAW264．7胞内脂滴量明显减少，胆固醇流出实验结果表明，E0869 能增加其胆固醇的流出。 3．1120的抗动脉粥样硬化活性研究及其作用靶标研究 Western blot和RT-PCR实验表明，R20能上调肝细胞HepG2中ABCAl、CLA．1 以及ABCGl的mRNA以及蛋白水平，但不影响FAS、SREBP—lc的表达。巨噬细
11、 胞泡沫化实验表明，R20能使泡沫化巨噬细胞RAW264．7胞内脂滴量明显减少，胆 固醇流出实验结果表明，R20能增加其胆固醇的流出。 R20是本实验室合成的RUT的衍生物，RUT是TRPVl的激动剂，文献表明激 活TRPVl能够上调ABCAl的表达，与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病有着密 切的关系。所以，R20有可能是通过激活TRPVl来上调ABCAl的表达，从而发挥 其抗AS的作用。为了进行进一步的验证，我们构建了人TRPVl激动剂筛选模型， 以进行进一步的筛选和检测。通过检测我们发现R20在人TRPVl激动剂筛选模型 上表现出了良好的活性。 同时，我们对R20进行了初步的体内活性
12、研究，apoE4小鼠实验结果表明，R20 还能够显著降低小鼠血清中TC、TG以及LDL—C的含量，对HDL—C的含量有一定 的升高作用。此外，R20能够显著上调小鼠肝脏中ABCAl、SR．BI、ABCGl以及 LDLR的蛋白及mRNA水平，但对FAS、SREBP．1c的表达有一定的抑制作用：R20 还能显著减轻肝脏中的脂质堆积。 综上所述，本论文通过ABCAl、CLA．1表达上调剂筛选模型进行筛选，获得 了两个活性化合物E0869和R20，我们进一步对E0869、R20在细胞水平确证了其 药效学活性。为了寻找ABCAl、CLA一1表达上调剂作用靶标，我们构建了人TIuVl 激动剂筛选模型，通
13、过检测我们发现R20具有良好的激动活性。同时，我们对活性 较好的R20进行了初步的体内活性研究。本论文工作为寻找新型抗动脉粥样硬化药 物或其先导化合物奠定了基础，具有重要的理论和实践意义。 关键词：ABCAl；SR-BVCLA．1：上调剂；TRPVl；激动剂；动脉粥样硬化 2 万方数据
14、 ABSTRACT Cardiovascular disease is a major killer of the human health in developed countries and most developing countries，and atherosclerosis(AS)is the pathological basis of many serious cardiovascular disease．The pathophysiology of AS is the damage of endothelial cells，and the dep
15、osition of macrophage cells or vascular smooth muscle cells in the vessel wall leading to the formation of foam cells．This makes the arterial wall thickening constantly,and ultimately causes atherosclerosis．ATP—binding cassette transporter A 1(ABCA 1)and scavenger receptor class B type I(SR·BI)are t
16、he key proteins in reverse cholesterol transport(RCT)，and they play an important role in in the process of removing the excess lipids．Human laJ【gh-density lipoprotein receptors are called CLA．1．ABCAl and SR—BI／CLA一1 is considered to be the potential targets to prevent or treat atherosclerosis．
17、 We have got the active compound Rutaecarpine(RUT)by a cell—based HTS method for up．regulators of ABCAl and CLA一1．and further study have shown that RUT suppresses atherosclerosis through up-regulating ABCAl and SR—B1 within RCT．RUT is the agonist of the transient receptor potential cation channel
18、subfamily V memberl (TRPVl)．Recent studies have shown that the transient receptor potential cation channel subfamily V memberl(TRPVl)is closely associated with cardiovascular diseases such as atherosclerosis．hypertension and SO on．Activating TRPV l causes the influx of calcium and a series of intra
19、cellular signaling，to play its role in cardiovascular protection． Ma and others found that activation of TRPV 1 can upregulate the expression of ABCA 1， and it iS related with atherosclerosis． Because ABCAl and SR-BI／CLA一1 play important roles in AS，we aimed at the two receptors to progress t
20、he following anti—atherosclerosis researches and its upstream target mechanism researches． 1．The discovery of the upregulators ofABCAl and CLA一1 Firstly,we screened the compound library to search for active compounds that Can increase ABCA 1 and CLA．．1 expressing level by a cell—based HTS
21、 method for 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文 ABSTRACT up-regulators of ABCA 1 and CLA·1．Among the compounds screened，E0
22、869 and R20 were found as the positive hit． 2．The anti—atherosclerotic activity of compound E0869 in vitro E0869 could upregulate the mRNA and protein levels ofABCA 1、SR．BIJCLA．1 and ABCG 1 genes in HepG2 and RAW264．7 cells by Real·Time Quantitative PCR and Western blotting analysis，but c
23、ould not influence the expression of FAS、SREBP．1 c and CD36．Foam cell assay showed that E0869 could inhibit lipids accumulation in mouse peritoneal macrophages RAW264．7．Cholesterol efflux assay showed that E0869 could induce HDL—mediated cholesterol efflux in mouse peritoneal macrophages RAW264．7．
24、 3．The anti-atherosclerotic activity and mechanism research of compound R20 The active compound R20 was studied on cell level，and the results show that the active compound R20 could upregulate the mRNA and protein levels ofABCAl、CLA一1 and ABCG 1 genes in HepG2，but could not influence the expre
25、ssion of FAS and SREBP—l c．R20 could inhibit lipids accumulation and induce HDL—mediated cholesterol effiux． R20 is the derivative of the RUT,and RUT is the activator of TRPV 1．Recent studies shows that activation of TRPVl can upregulate the expression of ABCAl and it is closely related with athe
26、rosclerosis，hypertension and other cardiovascular diseases． Therefore，R20 is possible to upregulate the expression of ABCA 1 through the activation of TRPV 1，which plays a role in anti—atherosclerosis．For further identification，we established a TRPVl agonist screening model for further screening and
27、 testing．We found that R20 showed good activity in the TRPVl agonist screening model． Then，we conducted a study in vivo about the activity of R20．The apoE_／一mice results showed that R20 could upregulate the mRNA and protein levels of ABCA 1、 SR-BI、ABCG 1 and LDLR genes in liver,but could inhibit
28、 the expression of FAS and SREBP-lc．R20 can significantly reduce the content of TC，TG，LDL-C in serum and increase the content of HDL·C．The oil red staining experiment shows that reduce lipids accumulation in mouse liver． 4
29、 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文 ABSTRACT In conclusion，we obtained the active compounds E0869 and R20 through the screening model for upregulators of ABCA 1 and CLA一1，and we identified the two active compounds in vitro．To find the ta
30、rget of the upregular of ABCAl and CLA一1，we established a TRPV 1 agonist screening model．and we found that R20 showed good activity in the TRPVl agonist screening model．Then，we identified this active compound in vivo．Our researches made foundation for the discovery of drug candidates or lead compoun
31、ds of new anti-atherosclerotic agents Keywords：ABCA 1：SR-BI／CLA一1；upregulator；TRPV l；agonist； atherosclerosis
32、 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文 缩略语表 缩略语表 缩略名 英文名 中文名 ABCAl ATP-binding cassette transporter ，Al ABCGl ATP-binding casse饥e transporter ，G 1 ATP 结合盒转运子 Al ATP 结合盒转运子 Gl ApoA-I apolipoprotein A-I 载脂蛋白 A-I ApoE apolipoprotein E 载脂蛋白 E AS atheros
33、clerosis 动脉粥样硬化 bp base pair 碱基对 BSA bovine serum albwnin 牛血清白蛋白 CD36 cluster of differentiation 36 抗原分化群 36 cDNA complementary DNA 互补脱氧核糖核酸 CE cholesterol ester 胆固醇酶 CHD coron缸y heart disease 冠心病 DEPC diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酶 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚枫 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖
34、核酸 E. coli Escherichia co/i 大肠(埃希氏〉杆菌 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 HDL high density lipoprotein 高密度脂蛋白 高密度脂蛋白胆固 HDL-C high density lipoprotein cholesterol 醇 HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 HTS high throughput screening 高通量筛选 kDa kilo dalton 千道尔顿 Kan kanamycin 卡那霉素 LDL low density lipopr
35、otein 低密度脂蛋白 LXR liver X receptor 肝 X 受体 Luc luciferase 萤火虫荧光素酶 OD optical density 光密度 OxLDL oxidized LDL 氧化低密度脂蛋白 聚丙烯酷肢凝胶电 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 泳 6 北京协和医学院硕士学位论文 缩略语表 缩略名 英文名 中文名 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR pol严nerase chain reaction 聚合酶链式反应 PMSF P
36、henylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酸氟 过氧化物酶体增殖 PPAR peroxisome proliferator-activated receptor 物激活受体 RCT reverse cholesterol transport 胆固醇逆转运 RNA ribonucleic acid 核糖核酸 RNaseA ribonuclease A 核糖核酸酶 A 逆转录.聚合酶链式 RT-PCR reverse transcription PCR 反应 RUT Rutaec缸pine 吴莱英次碱 RXR retinoid X rece
37、ptor 视黄酸 X 受体 SDS sodium dedec泸州也te 十二皖基硫酸纳 SR-BI scavenger receptor class B type 1 清道夫受体 B 族 I 型 固醇调节元件结合 SREBP-lc sterol regulatoy element-binding protein-l 蛋白 TAE Tris-acetate-EDTA buffer TAE 缓冲液 TBS Tris-buffered saline Tris 盐缓冲液 TC total cholesterol 总胆固醇 TD Tangier dise
38、ase 丹吉尔疾病 TE TE岛'IED Tris-HCl ，EDTA buffer N， N， N' ，N '-tetramethylethylenediamine TE 缓冲液 四甲基乙二胶 TG triglyceride 甘油三酶 Tris trihydroxymethylaminomethane 三是甲基氨基甲炕 TRPVl Transient Receptor Potentialcation channel 瞬时受体电位香草 subfamily V memberl 醒亚家族 l 北京协和医学院硕士学位论文 前言
39、 前言 动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)引起的心肌梗死、中风、甚至猝死等心 脑血管疾病己成为西方发达国家的第一位死亡原因。随着人们生活水平提高和生活 习惯的改变，心脑血管疾病无论在发展中国家还是发达国家，其发病率均呈现明显 上升趋势。近年来的基础研究与临床研究结果提示，AS是一种与脂质代谢紊乱相 关的全身血管的阻塞性的慢性炎症性疾病【l】【21。巨噬细胞结合并吞噬氧化的低密度 脂蛋白(oxidatively modified low—density lipoprotein，Ox—LDL)，造成脂质在细胞内 蓄积以及泡沫化细胞的形成，进而在血管内壁堆积形成脂质纹
40、理，是AS起始和发 展的主要原因。 高密度脂蛋白胆固醇(High-densitylipoproteincholesterol，HDL—C)水平与冠状 动脉心脏病(coronary heart disease，CHD)的发生成负相关，并且它是预测心血管 疾病风险的一个重要组成成分【3】。HDL．C可以延缓动脉粥样硬化的发生与发展，其 机制主要是通过促进胆固醇的逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)【4】。RCT 过程中，高密度脂蛋白(High—density lipoprotein，HDL)将胆固醇从周围组织(包 括动脉粥样斑块)转运到肝脏进
41、行再循环或以胆酸的形式排泄，从而减轻动脉粥样 硬化病灶。ATP结合盒转运体A1(ATP．binding cassette transporter A1，ABCAl)和 清道夫受体BI(scavenger receptor class B type I，SR—BI)是介导RCT的两个关键 蛋白[习。人源的高密度脂蛋白受体被称为CLA．1。 ABCAl基因位于常染色体9q31上，其完整的基因序列包括1,453bp的启动子、 146，581bp的内含子和外显子以及lkb的3’侧翼区，人ABCAl蛋白由2261个氨基 酸组成，分子量为220kDa[6’。71。ABCAl的主要功能是参与RCT，
42、它可以将细胞内 的胆固醇和磷脂转运至HDL的前体蛋白apoA．I，这是RCT的第一个限速环节【8】。 ABCAl的缺失或基因突变，能够导致血浆HDL胆固醇的降低，从而增加动脉粥样 硬化和冠状动脉疾病的风斛91。ABCAl缺失，还可引发Tangier disease(TD)病，使 巨噬细胞内脂质聚积[10,11】。而ABCAl过表达的转基因小鼠，能增加apoA—I介导的 胆固醇流出【121。ABCAl基因的启动子区含多个转录因子的结合位点，其基因的表 达调控主要是通过核转录因子(包括肝脏x受体(LXRct／p)，视黄酸x受体(RXRn) 等)与ABCAl启动子区的特殊反应元件相互作用来实
43、现的D3q5]。有研究表明，过 氧化物酶体增殖物激活受体PPARs的激活能通过LXR来提高ABCAl的转录活性， 从而促进胆固醇的流出【l 6l。 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文 前言 SR．BI是位于细胞表面的糖蛋白，含有两个跨膜域、两个胞浆域和一个大的胞 外结构域，共有408个氨基酸残基组成[1
44、71。SR．BI在肝脏中大量表达[18,19]。CLA一1 具有509个氨基酸残基，有多个糖基化位点。在RCT起始过程中，SR-BI结合HDL， 促进胆固醇外流，防止其在外周动脉壁的堆积，SR．BI还可以介导选择性摄取HDL 的胆固醇酯[20,21]。研究表明，SR-BI的突变可以导致巨噬细胞中胆固醇流出的减少 【22]。在apoE乒小鼠中，sR—BI的失活可以促进动脉粥样硬化病变发展[23】。ABCAl 和SR．BI／CLA．1在RCT中以及AS中的重要作用表明，ABCAl、SR-BI／CLA—l可 能是治疗AS的靶标，能升高ABCAl和SR．BUCLA一1基因表达的化合物有望成为 有效
45、治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的新型药物。 实验室前期在已有的ABCAl和CLA．1表达上调剂筛选模型上发现了吴茱萸次 碱(Rutaecarpine，RUT)这个活性较好的化合物，进一步研究发现RUT在体内能上 调ABCAl、SR—BI的表达，具有较好的抗AS作用。RUT是瞬时受体电位香草醛亚 家族l(Transient Receptor Potential cation channel subfamily V memberl，TRPVl) 的激动剂，近期研究已表明，在血管平滑肌细胞中，激活TRPVl能够通过钙调蛋 白和PKA依赖的机制增加ABCAl的表达，以减缓动脉粥样硬化[241。 基于以
46、上的 研究，我们推测TRPVl可能是位于ABCAl、SR．BFCLA．1上游的靶标。 TRPvl属于瞬时受体电位通道(transient receptorpotential channel，TRP)家族， 它可以介导胞外钙内流[25之71。TI冲V1由839个氨基酸构成，它的分子量约为95kDa， 亲水性分析显示它有6个跨膜区。它可以被热、质子、辣椒素以及各种内源性脂质 激活，导致以Ca2+为主的跨膜离子流动，进而触发细胞内相关信号，发挥其生理作 用。Ca2+对AS的影响是多方面的，Ca+可介导血管平滑肌细胞的增殖、胆固醇的 沉积等病理过程‘28‘301。在TRPVl中，两个假定的磷酸化位
47、点已经被确定，分别是 丝氨酸残基502(Ser-502)和丝氨酸残基800(Ser-800)。Ser-502和Ser-800与TRPVl 的活化密切相关，被认为是新的潜在治疗靶标。最初，对TRPVl蛋白的研究主要 集中在镇痛方面[311。但近些年来的研究表明，激动TRPVl可产生与心血管相关的 作用：在巨噬细胞中，激活TRPVl能够抑制OX—LDL诱导的脂质堆积以及TNF．0L 诱导的炎症反应吲；激活TI冲vl可以改善内皮依赖性的血管舒张并预防高血压[3 31。 因此本论文研究的主要内容是：首先我们利用ABCAl和CLA．1上调剂筛选模 型，对化合物库中的化合物以及合成的RUT的衍生物进行了
48、筛选，得到了阳性化 合物E0869和R20，然后对E0869和R20进行了体外分子药理学研究。为了进一步 发现ABCAl和CLA．1表达上调剂的作用靶标，我们构建了人TRPVl激动剂的筛 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文
49、 前言 选模型。通过检测我们发现R20在TRPVl激动剂筛选模型上表现出良好的激动活 性。同时我们还对活性较好的化合物R20进行了初步的体内活性研究。本论文的工 作为揭示AS致病机制、寻找新型抗动脉粥样硬化药物或其先导化合物奠定了基础， 对防治心血管疾病研究具有重要意义。 万方数据
50、 北京协和医学院硕士学位论文 实验材料 实验材料 1．细胞株 (1)表达人TRPVl蛋白的稳定转染细胞株CHO[hTRPVl]细胞由本研究工作构建。 (2)人肝癌细胞株HepG2。 (3)小鼠单核巨噬细胞株Raw264．7。 (4)含有人ABCAl基因上游调控序列(一819～+67 bp)的荧光素酶报告基因的稳定转 染细胞株ABCA l p—LUC HepG2细胞。 (5)含有人CLA．1基因上游调控序列(一1055～一62 bp)的荧光素酶报告基因的稳定转 染细胞株CLA-lp-LUC HepG2细胞。 以上细胞均由本实验室保存。 2．菌株
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