新嗜热菌Thermoanarobacter-sp.YS13基因组序列以及生长和发酵性质的分析说课材料.docx

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华中农业大学2016届博士研究生学位论文

2．1．3主要仪器 ．．18

2．1．5溶液 19

2．2方法 21
2．2．I YSl3菌株的纯化和保藏 21
2．2．2 YSl3菌株的分子生物学鉴定 21
2．2．3 YSl3菌株在指定碳源中的生长和代谢 23
2．2．4不同培养温度下YSl3菌株的生长和代谢模式 24
2．2．5不同pH条件下YSl3菌株的生长和代谢模式 25
2．2．6 YSl3菌株可利用碳源的筛选 25
2．2．7 YSl3菌株发酵产物的测定和分析 25
2．2．8 YSl3基因组序列的测定 27

2．2．9比较基因组分析 ．28
3．1 YSl3菌株的分子生物学鉴定 29
3．2 YSl3菌株的碳源利用谱 32
3．3 YSl3菌株在不同碳源条件下的代谢模式 34

3．4影响Thermoanaerobacter sp．YSl3生长和代谢模式的条件 ．40

3．4．1温度对Thermoanaerobacter sp．YSl3生长和代谢产物合成的影响 40

3．4．2初始pH对Thermoanaerobacter sp．YS 1 3生长和代谢模式的影响 42

3．5 Thermoanaerobacter sp．YSl3基因组特征 46

3．6 Thermoanaerobacter菌株全基因组比较分析 。46

3．7 Thermoanaerobacter菌株基因组排列 。5 1

II

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新曙热菌Thermoanarobacter sp．YSl3基因组序列以及生长祀发酵性质的分析

3．8 Thermoanaerobacter菌株中同源基因和共享基因 。57

3．9 Thermoanaerobacter基因组中OHs分布 ．57

3．10 Thermoanaerobacter菌株的ABC碳水化合物转运体 。58
3．1 1 Thermoanaerobacter基因组碳水化合物代谢途径 61

致谢 ．85

附录 ．86

III

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新嗜热菌Thermoanarobacter sp．YSl3基因组序列以及生长和发酵性质的分析

摘要

全球人口的持续增长，环境问题的日益严重，以及传统化石燃料价格的大幅度 波动，导致了对生物新能源的需求与日俱增，特别是目前越来越多的科学研究旨在 寻找能合成生物能源的木质纤维素嗜热菌。Thermoanaerobacter属菌株含有多种专 性厌氧嗜热菌，甚至其中一些菌株是颇具发展前景的高产乙醇菌株并己进行了广泛 的性质研究。一方面，Thermoanaerobacter属菌株的生长和发酵产物的合成与培养 温度、培养基初始pH以及碳源类型都具有一定的相关性。另一方面，基因组序列 的测定，有利于从基因组学的角度剖析菌株的碳源利用能力和发酵产物的合成能力。

本研究中，加拿大湖首大学Lew Christopher教授从美国黄石公园的一处地热温 泉中分离得到一株专性厌氧嗜热菌YSl3。基于16S rRNA基因序列和cpn60 uT序 列的系统进化分析鉴定该菌株为Thermoanaerobacter属中一株新的嗜热菌并命名为

Thermoaanerobacter sp．YSl3。纤维二糖或木糖作为碳源条件下，Thermoaanerobacter sp．YSl3能在45．70 oC，初始pH 5．O．9．O条件下较好生长，最适生长条件为65。C， pH 7．0．7．5。YSl3菌株在1191培养基中以葡萄糖、纤维二糖或木糖为生长底物，其 代谢产物均为H2、C02、乙醇、乙酸和乳酸。YSl3菌株在葡萄糖或纤维二糖为碳源 条件下生长时，乳酸的合成占主导地位，而在以木糖为生长底物的1 191培养基中， H2和乙酸的合成量超过其他发酵终产物。当纤维二糖作为生长底物时，培养温度由 45。C升至70 oC，导致代谢平衡由乙醇转向H2、乙酸和乳酸。当木糖作为生长底物 时，随着温度由45 oC升至65。C，代谢平衡由乳酸的合成转移至H2、C02和乙酸的 合成，而培养温度升至70。C，代谢平衡又由乙醇和C02的合成转移至H2、乙酸和 乳酸的合成。YSl3菌株无论以己糖还是戊糖为碳源条件下，当培养基初始pH由7．0 降至5．0时，其发酵代谢平衡分别由H2、乙酸和乙酸的合成转移至乳酸的合成。

进一步地，由加拿大麦吉尔大学和魁北克基因创新中心对Thermoanaerobacter sp．YSl3基因组进行测序。YSl3菌株的基因组草图由5个contigs(>2,638 bp)组 成，总的基因组大小为2,713，030 bp，G+C含量为34．05％，含有2,779个基因，其 中2,707个为蛋白质序列编码基因，59个为tRNA，12个为rRNA。该基因组序列己
存放于DDJB／EMBL／GenBank，其编号为J00100000000。

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由Thermoanaerobacter sp．YSl3和其它16个已测序的Thermoanaerobacter菌株 基因组进行的比较分析结果显示，尽管17个Thermoanaerobacter菌株来源不同的区 域和环境，但是他们的基因组大小和G+C含量具有高度相似性。但是，不同 Thermoanaerobacter菌株基因组中潜在的侧向位移基因的数量和组成呈现明显的差
异性。Thermoanaerobacter sp．YSl3基因组含有最多的侧向位移基因，并且其中大 分部为潜在的功能性蛋白质序列编码基因，而其它Thermoanaerobacter菌株基因组 中或者含有较少量的侧向位移基因或者所含侧向位移基因多为假定性基因。另外， YSl3菌株与Z uzonensis全基因组序列比较分析呈现最高的分享基因百分比和核酸 同一性值，这与前面以16R rRNA基因序列和cpn60 UT序列为基础的系统进化分析
结果具有一致性。YSl3菌株与Z wiegelii Rt8．B1有最相似的基因组排列，而与

Thermoanaerobacter sp．X5 1 3、Thermoanaerobacter sp．X5 1 4，Z siderophilus SR4和 Z pesudethanolicus 39E在基因组排列上显示较大的差异性。有趣的是， Thermoanaerobacter sp．YSl3与Z uzonensis的基因组相似性是低于 Thermoanaerobacter sp．YSl3与Z wiegelii Rt8．B1相似性的，尽管它们在进化分析中 表现为最相近的关系。Thermoanaerobacter基因组中潜在的糖苷水解酶基因的多样 性与已进行性质研究的Thermoanaerobacter菌株多样的生物质水解表现型相关联。 由17个Thermoanaerobacter菌株基因组组成的泛基因组中包含7,041核心和独特基
因。通过对泛基因组进行分析，鉴定了28组来源于Thermoanaerobacte，．菌株的ATP 结合盒(ABC)转运体基因。值得注意的是，Thermoanaerobacter sp．YS 1 3菌株含 有4个独特的ABC转运体蛋白编码基因，这些基因处于泛基因组中 Thermoanaerobacter sp．YSl3菌株的独特区域，而且这些可能转运蛋白基因大多数 源于基因的侧向位移。糖酵解代谢途径在所有Thermoanaerobacter菌株高度保守， 不过，可能的糖代谢编码基因因菌株不同而呈现分布的多样性。尽管在所有分析的 Thermoanaerobacter基因组中均含有不同数量的乙醇合成相关基因，但是这些基因 大多数都是功能性质不确定的。

关键词：

厌氧嗜热菌，生物能源发酵，基因组测序和注释，基因组比较分析

万方数据

新嗜热菌z托瑚∞凇加蚰c据r sp．YSl3基因组序列以及生长和发酵性质的分析

Abstract

Increasing research has been dedicated to the exploration of lignocellulytic thermophilic bacteria for biofuel．The genus Thermoanaerobacter contains a diverse group of strictly anaerobic，thermophilica bacteria,and even，some of them have been
well characterized鹤promising ethanologens．Cell growth and fermentation end-products
synthesis were aSsociated with incubation temperatures，initial pH of medium，and the type of carbon SOUCe．On the other hand，the comparative analysis on genome sequence for related strains was carried in order to identify putative genes encoding key metabolic
enzymes，document the similar and difference on genome features，metabolic pathway，
and end-products synthesis．

In this study，a strictly anaerobic，thermophilic bacterium，designated strain YSl3，
Was isolated from a geothermal hot spring in YeUowestone National Park by Dr．Lew Christopher in the University of Lakehead．Phylogenefic analysis using the 1 6S dNA
and cpn60 UT sequences suggested strain YS 13 as a species of Thermoanaerobacter． Using cellobiose or xylose as carbon source，YS 1 3 Was able to grow over a wide-range of
temperatures(45—70 oC)，and pHs QH 5．0—9．O)，with optimum growth at 65 oC and pH
7．0·7．5．Metabolic profiling on eellobiose，glucose，or xylose in 1 191 medium showed
mat H2，C02，ethanol，acetate，and lactate were the major metabolites．Lactate was the predominant end-product from glucose or eellobiose fermentations，whereaS H2 and acetate were the dominant end-products from xylose fermentation．nle metabolic balance shifted away from ethanol to H2，acetate，and lactate when YS 1 3 Was grown on cellobiose as temperatures increased from 45 oC to 70 oC．Ⅵ[hen YS 13 was grown on xylose，a metabolic shift from 1actate to H2，C02，and acetate was observed in cultures as the
temperature of incubation increased from 45 to 65 oC，whereaS a shiR from ethanol and C02 to H2，acetate，and Iaerate WaS observed in cultures incubated at 70。C．Between cellobiose and xylose，the variation in pH from 7．0 to 5．0 resulted in a shift from H2， acetate，and ethanol to lactate．

Future，the genome of strain YS 1 3 WaS sequenced at the McGill University Genome Quebec Innovation Centre．The draft of genome consists of 5 eontigs(size>2．638 bp) with a total size of 2，71 3，030 bp，and a G+C content of 34．05％．nle draft genome WaS submitted to the Joint Genome Institute’S(JGI)Integrated Microbial Genomes-Expert
Review(IMG／ER)platform and annotated using their annotation pipeline．The annotated
iii

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genome sequence of Thermoanaerobacter sp．YS 1 3 is estimated to have a total of 2，779 genes，including 2,707 protein coding genes，59 tRNAs，and 12 rRNAs。The genome of strain YS 1 3 has been deposited at DDJB／EMBL／GenBank under the accession number J00100000000．

Comparative genomic analysis of between strain YS 1 3 and 1 6 other sequenced Thermoanaerobacter strains was conducmd．In spite of 17 Thermoanaerobacter strains were isolated several different region and different environment，they have high similarly on genome sizes and G+C contents．However，the putative horizontally transferred
genes showed a significant diversity for all Thermoanaerobacter genomes．Strain YS 13
has the most abundant putative horizontally transferred genes including a low proportion of hypothetical genes．Strain YS 1 3 shows most high percentage of shared genes and ANI score with Z uzonensis WaS consistent witll the phylogenetic analysis based on 1 6S rRNA and cpn60 UT sequences．Thermoanaerobacter genome arrangement Was strain YS 1 3 Was the most highly similar to Z wiegelii Rt8．B 1 but markly different than Thermoanaerobacter sp．X5 1 3、Thermoanaerobacter sp．X5 14，Z siderophilus SR4，and Z pesudethanolicus 39E．However，the similarity of strain YS 1 3 and Z uzonensis genome arrangement was lower than that of strain YS 1 3 and Z wiegelii Rt8．B 1，though
they were most closely related in phylogeny．The diversity of putative glycoside hydrolases in Thermoanaerobacter genomes was associated、析m different phenotypes of biomass hydrolysis for characterized Thermoanaerobacter strains．A total of 7,041 core and unique genes were represented the pangenome of 1 7 Thermoanaerobacter strains．28 sets of putative ABe transport genes were identified using pangenome anlaysis．4 of 28 ABC transport genes are unique for genome sequence of Thermoanaerobacter sp．YS 1 3， which may be caused as genes horizontally transferred．The glycolysis metabolism pathway WaS highly conserved for all sequenced Thermoanaerobacter strains，however， the distribution of putative saccharides metabolism·encoding genes was different with the
variation of Thermoanaerobacter strains．Although the ethanol synthesis-related genes

represent in all genomes，most ofthem were functionally uncertain．

Key words：

Anaerobic thermophiles，biofuel fermentation，genome sequence and annotation,

comparative genome analyses

1V

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新嗜热菌Thermoanarobacter sp．YSl3基因组序列以及生长和发酵性质的分析

ABC ATP-binding cassette 三磷酸腺苷结合转运盒

A但 Acetate／etahnol ratio 乙酸与乙醇含量比

A／L Acetate／lactate ratio 乙酸与乳酸含量比

BLAST Basic local alignment search tool 局部序列比对查询工具

bp Base pair 碱基对 CAZyme Carbohydrate active enzyme 碳水化合物活性酶 CBMs Carbohydrate bingding module 碳水化合物结合结构域
CBP Consolidate bioprocessing 联合生物加工 CEs Carbohy’drate esterase 糖酯酶类 COG Cluster of orthologous groups 蛋白直系同源簇
Chaperonin一60 universal target 伴侣蛋白60目标序列

dNTP Deoxyribonueleoside 脱氧核糖核苷酸混合物
triphosphate
DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 肌 Ethan01／1actate ratio 乙醇与乳酸含量比 EMP 糖酵解

GC Gas chromatography 气象色谱

gDNA Genomic DNA 基因组DNA
GenePR咖 Gene Prediction Im】印-oVeInent
n。’二^’‘。I，’。。。—【
peline：：1：‘‘—。74_L。。H
GHS Glycoside hydrolases 糖苷水解酶类

GTS Glyeosyltransferases 糖基转移酶类

V

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缩写词 英文 中文

IMG Integrated microbial genomes 综合微生物基因组
IMG．ER Intergrated microbial 综合微生物基因组专家评审
genomes-expert review
JGI Joint genome institute 联合基因研究所 京东基因与基金组百科全书直
KO KEGG orthology groups 系同源簇
National center for
NCBl 国家生物技术信息中心
biotechnology information
0D Optical density 光密度

Ratio of oxidized end-products to
O／R 还原氧化比
reduced end-products formed
ORFS Open reading frames 开放阅读框 PCR Polyrnerase chain reaction 聚合酶链式反应 PLs Plysaccharide lyases 多糖裂解酶类 PPP Pentose phosphate pathway 磷酸戊糖途径
Phosphotransferase system
PTS 磷酸转移酶系统
(transport)
Separate hydrolysis and
SHCF 分步水解联合发酵
CO．fermentation
SⅢ Separate hydrolysis and 分步水解发酵
fermentation
Simultaneous saccharification
SSCF 同步糖化联合发酵
and CO．fermentation
Simultaneous saccharification
SSF 同步糖化发酵
and fermentation

TCA Citric acid cycle 柠檬酸循环
TIGRFAM The粤stinn皇1警G曼nomic 基因组研究院家族。～ ’’
Research王‘amlly 一

Vl

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新嗜热菌Thermoanarobacter sp．YSl3基因组序列以及生长和发酵性质的分析

1．文献综述

1．1生物能源发展概述

全球人口不断急剧增长，化石燃料价格持续波动，以及使用传统化石燃料对环 境造成的破坏性影响导致了可再生的新能源需求与日俱增(Weber et al，2010)。目前，
利用甘蔗、玉米、小麦和甜菜等粮食作物作为原料第一代生物能源(特别是生物乙

醇)的生产已进入工业化时代(Tayloretal，2009，Weberetal，20LO)。但是由于第一代 生物能源的生产与食品工业竞争从而导致了食品工业和土地利用等方面带来了负面

影响(Thompson,2012)。不管怎样，第二代生物能源利用非食品的木质纤维素类农业 和林业废弃物作为生产原料(Dutta et al，2014，Prasetyo&Park，2013，Singh ct al， 2012)。据报道，世界上50％9上的生物质为可再生木质纤维素类生物质(Bayer et al， 2007，Lynd et al，2008，Mielenz,2001，Wiegel，1982)。来源于木质纤维素生物质的生物 乙醇的生产不仅原料来源广泛且价格低廉，而且还能有效的避免第一代生物能源生 产给生态、农业以及食品业带来的诸多问题(Srivastava ct al，2014)。因此，木质纤维 素生物质被公认为目前最合适的生物能源生产原料。目前，第三代生物能源已处于 初级研究阶段。海藻含有脂类、蛋白质和碳水化合物，并且含有较薄的纤维素细胞 壁。尽管海藻的脂类物质通常被提取并用作转化生物才有，但是其细胞壁中的纤维 素可用作转化生产生物乙醇。其中，Glaeilaria和Euglena gracilis两种藻类菌株是目
前最受瞩目的第三代生物能源生产菌株。藻类生产生物柴油和生物乙醇还具有一个

优势就是能利用C02作为发酵碳源，对目前清洁能源的牲畜具有深远的影响，但是

其生产过程在现阶段还不被考虑作为工业化生产的应用(Baeyens ct al，2015)。

1．2木质纤维素类生物能源的生产

第二代生物能源作为目前最为关注的生物能源，可通过多种生产过程实现木胶 产物的生产。前处理是由木质纤维素生产生物乙醇的第一步也是整个生产过程中最 具挑战性的部分(Smgh et al，2012)。木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素组成
的复杂结构物质。在前处理过程中，纤维素的复杂结构被破坏转化为自由纤维素便 于后续酶反应释放可发酵的糖类。理论上，未经前处理过程的纤维素水解程度不及 20％， 相对地，迸前处理后的纤维素水解可达到90％左右(Srivastava et al，2014)。

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图1-1木质纤维素生物质转化生产生物能源的策略

Fig．1-1 Strategies for the conversion of U驴Oce¨ulose biomass to biofuels

前处理后的木质纤维素可通过分步水解发酵 (S耶)、同步糖化发酵(SSF) 或者联合生物加工(CBP)(图1．1)任何一个过程完成生物能源的生产。在SFF 和SSF流程中，需要添加商业生物质解构酶或者另外的生产单元中获得解构酶来完
成水解的过程(BhaUa et al，2013)(图1．1)，这也为生物能源的生产增加了成本的投 入。目前，联合生物加工过程(CBP)可在同一生产单元中完成酶的生产、前处理 生物质的水解以及水解产物发酵的生产流程，因其不涉及单独的酶生产单元而成为 目前最为经济有效的生物能源生产过程(Olson et al，2012)。

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新曙热苗Thermoanarobacter sp．YSl3基因组序列以及生长j}Ⅱ发酵性质的分析

如上所述，木质纤维素生物能源生产的最大桎梏是木质纤维素生物质的解构 (Himmel et al，2007)。无论怎样，某些微生物能对木质生物质材料进行一定程度的解 构(Himmel et al，2010)，甚至某些具有转化植物生物质为可发酵糖类的微生物可参与
无前处理或少前处理过程的CBP生产生物能源。普遍认为，赋予无解构生物质能力

的生物能源生产菌株以成百上千的生物质解构相关基因比在生物质解构微生物中镶 嵌一个生物能源生产的代谢途径要难上很多。总得来说，实现通过CBP获得工业化 要求的生物能源(主要是生物乙醇)还需要更多的努力去解决木质纤维素的解构和 微生物发酵产物产量低等问题。因此，新发现的微生物的鉴定以及基因组序列的测 定，利用基因工程和代谢工程来改造己存在的生物能源生产微生物以便提升水解能 力和转化效率是目前第二代生物能源工业生产的研究重点所在(Clomburg& Gonzalez，2010，Shaw et al，2008，Yao&Mikkelsen，2010，Zaldivar et al，2001)。

1．3木质纤维素生物能源发酵菌株

木质纤维素的水解产物是包含有六碳糖、五碳糖以及某些可能发酵抑制物组成 的复杂混合物。理想的生产木质纤维素类生物能源的菌株应该：高效的代谢己糖和 戊糖，最好能够进行同时发酵；对发酵抑制物和发酵产物具有高耐受性；对微生物 污染具有高抗性。同时，能生产水解纤维素和半纤维素酶类也是木质纤维素生物能 源生产菌株需要满足的重要条件之一。

1．3．1典型的生物能源生产菌株

目前典型的生物能源相关的野生型菌株，如Saccharomyces cerevisiae， Zymomonas mobilis和Escherichia cob等，尽管都具有生产乙醇的能源，但是仍不能 满足木质纤维素类生物能源生产的全部要求。

Saccharomyces菌株是以葡萄糖(或六碳糖)作为发酵碳源高效生产第一代生物 乙醇的传统菌株，并且具有较高的乙醇耐受性。但是，所有Saccharomyces天然菌 株均缺乏代谢戊糖的能力，从而不能利用木质纤维素水解产物中的木糖和阿拉伯糖
等戊糖进行生物能源的发酵(Dellomonaco ct al，2010，Ho et al，1998)。另外有一些酵 母菌，比如Pichia stipitis和Candida shehatae，它们能发酵木糖等五碳糖生产乙醇， 但是它们具有较低的乙醇耐受性(Jeffries，1985)。因此，它们也不适合作为大规模的

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木质纤维生物质类乙醇的生产菌株。另一方面，&cerevisiae除了能利用单糖如葡萄 糖作为生产底物，还能利用蔗糖和麦芽糖等二糖生产乙醇，甚至某些Saccharomyces 菌株还能利用蜜二糖、蜜三糖和麦芽三糖(Ostergaard et al，2000，Stambuk ct al，2006)。
但是，S cerevisiae却不能利用由纤维素水解而来的纤维二糖和纤维寡糖作为生长底

物。目前，这些野生Saccharomyces菌株中存在的不适合第二代生物能源生产的因 素均通过基因工程等手段得到较大程度的解决。Lv,女n，将P．stipitis中的木糖还原酶 和木糖脱氢酶基因在Saccharomyces菌株中成功表达，同时过表达S cerevisiae的木 酮糖激酶基因使得Saccharomyces菌株具有木糖代谢途径，甚至还能进行六碳糖和 五碳糖的同步发酵(Ho et al，1998)。再者，通过在