早期给予黄芪红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡及Caspase.docx

早期给予黄芪红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡及Caspase【摘要】 目的 探讨大鼠实验性脑出血后早期给予黄芪红花注射液对血肿周围细胞凋亡及细胞凋亡因子Caspase-3等指标的影响。方法 将176只SD大鼠随机分成3个治疗组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治疗组。各组均于脑出血后第72h处死，取脑，连续切片作TUNEL染色和Caspase-3免疫组化染色。观察不同时间单味及联合用药对大鼠神经功能评分、血肿周围细胞凋亡数目及凋亡相关蛋白Caspase-3等指标的影响。结果 与出血对照组比较，各药物治疗组的神功能评分降低、Caspase-3蛋白阳性细胞数减少、TUNEL阳性细胞数减少，黄芪红花联合组的Caspase-3蛋白阳性细胞数和TUNEL阳性细胞数低于单味用药组；黄芪组和黄芪红花联合组在出血前24h和出血后0、6h给药治疗的Caspase-3蛋白阳性细胞数低于出血后24h治疗组；黄芪组和黄芪红花联合组在出血后6h给药治疗组的TUNEL阳性细胞数低于出血后24h治疗组。结论 黄芪注射液、红花注射液和黄芪红花注射液治疗脑出血，均能不同程度的促进脑出血大鼠神经功能的恢复，降低血肿周围凋亡细胞的表达，尤以黄芪红花注射液术后6h联合治疗组表现最为明显。【关键词】 脑出血；黄芪注射液；细胞凋亡；红花注射液；大鼠 【Abstract】 Objective To study the effect of Astragalus and Safflor injection on apoptotic cell and protein about apoptotic cell in the early time after the experimental intracerebral hemorrhagein176 rats were randomly divided into the remedial group with ICH consisting of astragalus remedial group，safflor remedial group，combining astragalus and Safflor remedial group，and the contrast group including ICH contrast group with ICH and normal contrast group without ICH. Then each group of rats was divided into five groups which were 24 hours ahead remedial group，0，6，12 and 24 hours remedial group. All rats involved in the experiment were killed on seventy second hours following ICH. The immunohistochemical method was performed in rat brain by using antibody caspase-3. TUNEL method was used to detect apoptosis around theCompared with ICH model group，each remedial group could significantly alleviate neurological system damage symptoms，reduce the number of caspase-3 positive cell and the number of TUNEL positive cell around hematoma in ICH rats. The number of caspase-3 positive cell and the number of TUNEL positive cell around hematoma of combining astragalus and safflor group were significantly less than that of safflornumber of caspase-3 positive cell of astragalus group and combining astragalus and safflor group treated before ICH 24 hours,after ICH 0 hour and after 6 hours were less than that of astragalus group and combining astragalus and safflor group treated after ICH 24number of TUNEL positive cell of astragalus group and combining astragalus and safflor group treated after ICH 6 hours were less than that of astragalus group and combining astragalus and safflor group treated after ICH 24When astragalus injection,safflor injection,combining astragalus and Safflor injection are used earlier to cure ICH,it can decrease the rate of cell apoptosis and capase-3 protein expression,around the hematoma,especially the combining astragalus and safflor group treated after ICH 6 hours more significantly. 【Key words】 Intracerebral hemorrhage; astragalus injection; apoptosis; safflor injection; rat 脑出血是一种严重危害人类生命健康的临床常见病和多发病，是脑卒中死亡率最高的临床类型。迄今为止对脑出血的治疗虽较以往有很大进步，但脑出血急性期仍无肯定、有效的治疗方法，脑出血仍具有相当高的死亡率。千百年来中医中药在脑卒中的治疗得以广泛的应用，近年来部分学者应用益气活血法治疗急性期脑出血取得了一定的疗效，但对治疗的时机尚存在较大的争议。 1 材料与方法材料动物 SD大鼠雌雄不限176只，体重230280g，由宁夏医学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK20050001。主要试剂 黄芪注射液；红花注射液；型胶原酶；TUNEL 检测试剂盒，Caspase-3多克隆抗体，DAB染色试剂盒。方法动物分组 将大鼠随机分成黄芪注射液治疗组、红花注射液治疗组、黄芪红花注射液联合治疗组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治疗组。各黄芪治疗组每日腹腔注射黄芪注射液1次，剂量为/，各红花治疗组每日腹腔注射红花注射液1次，剂量为/；各黄芪红花治疗组每日先腹腔注射黄芪注射液1次，剂量为/，10min后在腹腔的另一侧再注射红花注射液1次，剂量为/；正常对照组和出血对照组每日腹腔注射等量生理盐水1次。每日进行神经功能评分1次，各组大鼠均于脑出血后第72h处死。脑出血大鼠模型制作 根据脑立体定位图谱于大鼠前囟后，中线右侧旁开钻孔，暴露硬脑膜。微量进样器吸取/l型胶原酶和/l肝素的混合液l，以硬脑膜平面为零点，缓慢进针，深度为，缓慢注入药物，注射完毕后留针10min，缓慢退出微量进样器，清洁伤口，缝合头皮，术后保温。免疫组织化学染色 石蜡切片，采用SP法，DAB显色，光学显微镜下观察。于 200 倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在2、4、6、8、10、12六个时钟点中选择5个不重复视野区，计数阳性细胞数，计算平均值。细胞凋亡的检测 取与免疫组化染色相邻石蜡切片,采用末端脱氧核糖核苷转移酶介导的dUTP缺口末端标记法，DAB显色，光学显微镜下观察。于 200 倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在2、4、6、8、10、12六个时钟点中选择5个不重复视野区，计数TUNEL反应阳性细胞数，计算平均值。统计学分析 计量结果用xs表示。统计学处理采用软件包进行t检验、方差分析,显着性水准均为=。2 结果大鼠神经功能缺损评分 麻醉苏醒后，模型组动物均出现不同程度神经功能缺损表现，根据Berderson评分标准对术后各组大鼠进行神经功能评分，各组评分情况见表1。Caspase-3免疫组化染色 Caspase-3蛋白表达以细胞浆或细胞核中呈棕黄色着色的颗粒为阳性细胞，以神经元细胞表达为主，并且主要集中在血肿周围脑组织。各治疗组均比出血对照组明显降低,。TUNEL染色 根据免疫组化的结果，选取差异较为显着的两个时间点进一步做TUNEL染色，TUNEL 阳性细胞以细胞膜周边染色质堆积染色呈棕黄色或细胞核着色呈棕黄色评判为TUNEL 阳性细胞。在血肿周边的外围，以神经元为主。ICH各组、各时间点凋亡细胞表达情况见表3。表1 脑出血后各时相点神经功能评分注：，VS ICH group表2 各药物在不同时间点给药时血肿周围Caspase-3阳性细胞记数注：，VS ICH group；，VS combining astragalus and Safflor remedial group；VS combining astragalus and Safflor remedial group，表3 各组在术后6、24h给药时血肿周围TUNEL阳性细胞数注：，VS ICH group；，VS combining astragalus and Safflor remedial group。 3 讨论 脑出血是指非外伤性脑实质内的自发性出血，是危害人类健康常见的一种疾病，它具有发病率高、致死率高、病残率高、复发率高等特点。在我国，脑出血占急性脑血管病的40%50%，是脑卒中死亡率最高的临床类型，约15%40%的脑出血患者死于急性期1。在治疗上目前临床上除运用传统脱水药，手术清除血肿外，治疗手段较少，无其他特效的方法，且相当部分脑出血患者虽早期行血肿清除，但预后仍然不佳，所以临床上一般采取内科保守对症治疗2。千百年来中医中药在脑卒中的治疗中积累了丰富的经验，近年来有部分学者尝试应用益气活血法治疗急性期脑出血取得了较好的疗效3，但其对脑出血治疗的时机问题尚存在较大的争议。 脑出血属中医“中风”、“卒中”病的范畴。中医理论认为气血是脑生长发育和产生各种功能的物质基础，气血失常也是脑病发病的主要病机。出血性脑卒中是在气血内虚的基础上遇劳倦内伤、忧思恼怒、嗜食烟酒等诱因，进而引起脏腑阴阳失调，气血逆乱直冲犯脑，形成血溢脑脉之外所致，而离经之血为瘀血。用补气药，取“气能行血”、“气能摄血”之义，同时配合活血破瘀之品，消除血肿。 黄芪作为中药当中的一味经典补气药，具有免疫调节、抗菌利尿、强心，降低血液粘度、抗血小板聚集、扩张血管、降低血脂和改善微循环等作用，抗脂质过氧化、降低自由基生成或增加自由基清除、抗氧化及稳定细胞膜，保护线粒体，增加组织细胞抗缺血缺氧能力68。红花作为一种应用普遍的强活血药，临床广泛应用于脑中风的治疗，具有抑制血小板活化因子诱发血小板聚集、释放及血小板内游离钙浓度升高，抑制诱发的中性粒细胞聚集、黏附，提高大鼠的纤溶性；拮抗氧自由基，抑制缺血脑线粒体膜流动性的降低、线粒体肿胀、脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和降低细胞色素氧化酶活性，抑制Ca2+过多摄入，改善线粒体呼吸功能912。 近几年在脑出血的机制方面的研究取得了一定的进展，文献表明，脑出血后血肿周围脑组织血流量下降，相对于严重缺血性卒中而言属于轻中度脑缺血，轻微脑缺血伴随着大量激活的细胞因子外渗所导致的细胞凋亡，是脑出血后细胞死亡主要途径之一13。各种动物实验表明， 脑出血后46h细胞凋亡即开始出现，凋亡高峰在脑出血后4872h14。另外有研究表明：脑细胞缺血后先出现促凋亡基因表达，后出现神经元群体的凋亡，这就为治疗提供了时间窗，从理论上推测如果能在发病早期抑制了促凋亡基因的表达或促进抑制凋亡基因的表达，就能有效地保护神经元细胞的损伤。 哺乳动物的细胞凋亡至少由两条通路构成，即死亡受体通路和线粒体通路，这两条凋亡途径不是孤立的,后期的共同途径是Caspases的激活，其中caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位15。 本实验的研究结果显示，黄芪、红花、黄芪红花联合治疗脑出血均有效果，能有效改善脑出血模型大鼠的神经功能缺损症状，减少脑出血灶周围TUNEL染色阳性细胞数，减少脑出血灶周围凋亡蛋白Caspase-3的表达，与出血对照组相比较差异有显着性，黄芪红花联合治疗组的Caspase-3蛋白阳性细胞数和TUNEL染色阳性细胞数低于红花治疗组和黄芪治疗组。 众多的医家使用活血化瘀药多在脑出血的亚急性期开始使用。陈汝兴18临床也证实在出血性中风发病后6h内血肿会扩大，主张在发病6h之后尽快使用活血化瘀药物并获满意疗效，并认为超早期应用较亚急性期应用者血肿吸收为快。况时祥19认为活血化瘀药在脑出血急性期的主要作用还在于改善由出血而引发的血液循环障碍，减轻脑组织的缺血缺氧损伤，而并非消除血肿或减轻脑水肿，并认为发病后624h内应为应用活血化瘀类药的最佳时机。对本实验不同时间用药的结果进行分析表明，黄芪注射液在大鼠脑出血后0、6、12、24h给药治疗时，出血灶周围Caspase-3阳性细胞逐渐增多，并且0h和6h组与12h和24h组的差异有显着性，提示黄芪注射液在早期用药效果比较理想。红花注射液和黄芪红花注射液在大鼠脑出血后6h以前给药治疗，与大鼠脑出血后6h以后给药治疗相比较出血灶周围Caspase-3阳性细胞明显增多，提示红花注射液和黄芪红花注射液在出血后6h以前用药效果不理想，可能与红花注射液在出血同时给药时抑制血小板聚集9，加重脑出血有关。红花注射液和黄芪红花注射液在大鼠脑出血后6h、12h、24h给药，出血灶周围Caspase-3阳性细胞逐渐增多，并且黄芪红花联合治疗的6h组与24h组的差异有显着性，与TUNEL染色结果相一致，提示红花注射液和黄芪红花注射液在大鼠脑出血6h以后尽早用药效果比较理想，推测其可能与抑制Caspase-3蛋白的表达，从而降低血肿周围凋亡细胞的表达有关。另外在本实验中，在大鼠脑出血后0h给予红花治疗，有1例血肿周边可见到新鲜出血灶，说明出血6h以内应慎用红花来治疗脑出血。但在脑出血后康复治疗阶段应用红花注射液和黄芪红花注射液治疗脑出血的效果如何有待于进一步的研究。 综上所述，黄芪注射液、红花注射液和黄芪红花注射液治疗脑出血，均能不同程度的促进脑出血大鼠神经功能的恢复，降低血肿周围凋亡细胞的表达，其中黄芪红花注射液联合治疗脑出血对血肿周围凋亡细胞表达的降低程度比单纯的红花注射液治疗明显，尤其以黄芪红花注射液术后6h联合治疗组表现最为明显。 【参考文献】 1 陈灏珠. 实用内科学，第10版. 北京:人民卫生出版社，1997，2216. 2 Juvela S，Heiskanen O，PoranenA，et al. 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