松茸粗多糖的提取工艺优化、单糖组成及体外抗氧化活性.pdf

引文格式：梁双敏,国琦,葛长荣,等.松茸粗多糖的提取工艺优化、单糖组成及体外抗氧化活性J.云南农业大学学报(自然科学),2024,39(2):108118.DOI:10.12101/j.issn.1004-390X(n).202204003松茸粗多糖的提取工艺优化、单糖组成及体外抗氧化活性*梁双敏1,2，国琦1,2，葛长荣1，肖智超1,2*(1.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南昆明650201；2.云南农业大学食品科学与技术学院，云南昆明650201)摘要:【目的】提高松茸粗多糖提取率，探究松茸多糖纯化组分及抗氧化作用。【方法】采用超声波辅助水提醇沉法提取松茸粗多糖，优化提取工艺，使用 DEAE-SepharoseFastFlow 离子柱分离纯化粗多糖，采用离子色谱法分析单糖成分，并测定体外抗氧化活性。【结果】最优提取工艺参数为：浸提时间 2.25h，料液比 131(gmL)，浸提温度 83.50，该条件下多糖提取率为 8.67%。松茸粗多糖经分离纯化后收集到 3 种多糖组分(TMP-1、TMP-2、TMP-3)，主要由岩藻糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，其中 TMP-1 存在鼠李糖，TMP-2 和 TMP-3 存在葡萄糖醛酸。松茸粗多糖和 3 种纯化多糖组分均具有一定的抗氧化活性且存在量效关系，抗氧化能力强弱为：松茸粗多糖TMP-2TMP-3TMP-1。【结论】松茸多糖有一定的抗氧化活性，且松茸粗多糖效果最好，分离纯化后的多糖组分抗氧化活性有所降低。本研究为松茸多糖的开发利用提供了理论基础，对其功能食品研发具有重要意义。关键词:松茸多糖；提取工艺；分离纯化；单糖组成；抗氧化活性中图分类号:S646.150.1文献标志码:A文章编号:1004390X(2024)02010811Optimization Extraction,Monosaccharide Composition andAntioxidant Activity in Vitro of Polysaccharide fromTricholoma matsutakeLIANGShuangmin1,2，GUOQi1,2，GEChangrong1，XIAOZhichao1,2(1.LivestockProductProcessingandEngineeringTechnologyResearchCenterofYunnanProvince,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China;2.CollegeofFoodScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)Abstract:PurposeToimprovetheextractionrateofTricholoma matsutakecrudepolysacchar-ide,and explore the antioxidant effect of T.matsutake polysaccharide(TMP)purified fractions.MethodsThecrudeTMPwasextractedbyultrasonicassistedwaterextractionandalcoholpre-cipitation,andtheextractionprocesswasoptimized.ThecrudeTMPwasseparatedandpurifiedbyDEAE-SepharoseFastFlowioncolumn,themonosaccharidecomponentswereanalyzedbyionchro-matography,andtheantioxidantactivityin vitrowasdetermined.ResultsTheoptimalextraction收稿日期：2022-04-05修回日期：2024-04-11网络首发日期：2024-05-14*基金项目：云南省博士后基金项目。作者简介：梁双敏(1996)，女，云南玉溪人，在读硕士研究生，主要从事功能性食品研究。E-mail：*通信作者 Correspondingauthor：肖智超(1985)，男，云南昆明人，博士，副教授，主要从事畜产品加工和功能性食品研究。E-mail：网络首发地址：https:/ temperature was 83.50 ,under these conditions,the polysaccharide extraction rate was8.67%.Threepolysaccharidecomponents(TMP-1,TMP-2andTMP-3)werecollectedafterpurifica-tion,whichmainlycomposedoffucose,glucosaminehydrochloride,galactose,glucoseandmannose.RhamnoseexistedinTMP-1,andglucuronicacidexistedinTMP-2andTMP-3.CrudeTMPandpuri-fiedpolysaccharideshadcertainantioxidantactivityandtherewasadose-effectrelationship.Theanti-oxidantactivitywasasfollows:crudeTMPTMP-2TMP-3TMP-1.ConclusionTMPhascer-tainantioxidantactivity,andtheantioxidativeactivityofcrudeTMPisthebest.Theantioxidantactiv-ityofTMPafterseparationandpurificationisreduced.ThisstudyprovidesatheoreticalbasisforthedevelopmentandutilizationofT.matsutakepolysaccharides,andisofagreatsignificancefortheresearchanddevelopmentoffunctionalfoods.Keywords:Tricholoma matsutakepolysaccharides;extractionprocess;separatedandpurified;mono-saccharidecomposition;antioxidantactivity松茸Tricholoma matsutake(S.Itoetlmai)Sing又称松口蘑、松簟等，属担子菌门(Basidiomy-cete)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)口蘑属(Tricholoma)大型真菌1，在中国主要分布于吉林、四川、云南、西藏等地。松茸是世界上最珍贵的大型真菌之一，具有独特的风味和药理学特性2。其含有多种营养物质，如多糖、蛋白质、矿物质、维生素、低脂肪等，具有抗氧化、治疗糖尿病、抗癌等功效3。多糖是松茸的主要活性成分，也是目前研究最多的组分。临床研究证明：松茸提取物(多糖)具有美白、抗肿瘤、提高免疫力、抗病毒活性、抗炎、降血糖等作用4，在保健食品和医药领域具有广阔的开发前景。目前，有关松茸多糖的研究多集中于松茸粗多糖或提取分离的部分多糖，如：YIN 等5比较了热水提取法、酶辅助提取法、超声波清洗器提取法、静态探针超声波提取法和连续相微萃取法提取松茸多糖的差异；陈炼红等6采用复合酶法从松茸中提取了多糖；吴杨洋等7对比了热水浸提、超声提取、酶提取和微波提取法的松茸多糖提取率。但是，对于松茸多糖分离纯化后各组分单糖组成及结构、生物活性及其结构作用机制之间的关系尚不清楚。不同来源的松茸多糖结构可能存在差异，阻碍了松茸多糖的充分利用8。基于此，本研究采用超声波辅助水提醇沉法提取松茸多糖，利用响应曲面试验优化其提取工艺；对多糖进行分离纯化，对纯化后的组分进行单糖组成研究；测定松茸多糖对 DPPH 自由基和 ABTS 自由基的清除率、金属螯合离子能力以及还原能力，以评价其抗氧化活性。研究结果将为松茸多糖的进一步开发利用提供理论参考。1 材料与方法1.1主要材料与试剂松茸购自易门县山里香食品有限公司(产自云南省玉溪市易门县)；2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1-1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自天津市风船化学试剂科技有限公司；抗坏血酸(Vc)、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)购自上海源叶生物科技有限公司；16 种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)购自上海博睿糖生物技术有限公司。以上试剂均为分析纯。1.2主要仪器与设备A360 紫外分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；LGJ-10N 真空冷冻干燥机(北京亚星仪科发展有限公司)；H2-16RK 台式高速离心机(湖南可成仪器设备有限公司)；SCQ-9201B 超声波清洗器(上海声彦超声仪器有限公司)；ICS5000 离子色谱仪(美国 ThermoFisher 公司)。1.3试验方法1.3.1松茸粗多糖提取准确称取松茸粉末 5g(精确至 0.001)于烧杯中，以超纯水为提取溶剂，溶解后放入超声波提取仪(功率 600W，频率 40kHz)超声 20min，之第2期梁双敏，等：松茸粗多糖的提取工艺优化、单糖组成及体外抗氧化活性109后按照一定浸提时间、料液比和浸提温度进行提取；以 6500r/min 离心 20min，收集上清液，滤渣复提 2 次，合并上清液；旋转蒸发至 1/4 体积，加入上清液体积 3 倍的无水乙醇，醇沉(4，24h)；静置24h 后，以4000r/min 离心15min，沉淀物加入超纯水复溶，以 6500r/min离心 20min；冷冻干燥后置于80 保存，得到松茸粗多糖。以葡萄糖为标准，采用苯酚硫酸法测定松茸粗多糖的含量，绘制葡萄糖标准曲线，并计算松茸粗多糖提取率。松茸粗多糖提取率=松茸粗多糖质量/松茸预处理干粉质量100%。1.3.2单因素试验参考尹秀莲等9的方法。准确称取松茸粉末5g(精确至 0.001)，按照 1.3.1 节的方法提取粗多糖，在浸提温度 90、料液比 130(gmL)、浸提时间 2h 的条件下进行单因素试验，分别探究浸提温度、液料比和浸提时间对松茸粗多糖提取率的影响。1.3.3响应面优化设计在单因素试验基础上，利用 Box-Behnken 法设计优化试验，响应值为多糖提取率。响应面水平见表 1。表 1 响应面试验因素及水平Tab.1Experimentalfactorsandlevelsofresponsesurface因素factor水平level101浸提时间/hextractiontime123浸提温度/extractiontemperature758595料液比/(gmL)solid-liquidratio1201301401.3.4松茸粗多糖的纯化与分级采用 Sevag 法脱去松茸粗多糖中的蛋白质，收集样品，浓缩后透析 72h，得到脱蛋白松茸粗多糖。参照 BRADFORD10报道的考马斯亮蓝方法制备蛋白质标准曲线，测定多糖中的蛋白质含量。称取脱蛋白松茸粗多糖 0.3g 溶于 40mL蒸馏水中，充分溶解，通过 DEAE-SepharoseFastFlow 离子柱(4.6cm50cm)，依次用蒸馏水以及0.1、0.3 和 0.5mol/LNaCl 溶液洗脱，流速为2mL/min，收集洗脱液(每管 10.0mL)。以葡萄糖为标准，采用苯酚硫酸法跟踪测定各管中的多糖含量。依据洗脱峰型，收集同一峰洗脱液，经浓缩、透析、冻干，获得不同松茸多糖组分。1.3.5松茸多糖中单糖组成的测定取 16 种单糖标准品配制成约 10mg/mL 标准溶液，再精密配制为 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和 50.0mg/L 的梯度质量浓度标准品。用离子色谱仪(IC)分析纯化后松茸多糖组分的单糖组成11。取样品 5mg 于安瓿瓶中，加入2mol/LTFA10mL，120 水解 3h。氮吹后加入水 5mL 混匀，吸取 100L 加至 900L 去离子水中，12000r/min 离心 5min。取上清液进 IC分析，色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3mm150mm)；流动相：H2O(A)、250mmol/LNaOH(B)、50mmol/LNaOH 和500mmol/LNaOAC(C)；流速：0.3mL/min；进样量：5L；柱温：30C；检测器：电化学检测器。1.3.6不同组分松茸多糖体外抗氧化活性的测定(1)DPPH 自由基清除率的测定：参考 SONG等12的方法。取质量浓度为 0.25、0.50、1.00、2.00 和 4.00mg/mL 松茸粗多糖和各单糖组分溶液2.0mL，分别加入 0.2mmol/LDPPH 溶液 2.0mL，混匀，室温下避光静置 30min，测定波长 517nm处的吸光度值，以 Vc 为阳性对照，按公式计算DPPH 自由基的清除率：DPPH自由基清除率=1A1A2A0100%。式中：A0为空白对照组(超纯水代替样品)的吸光度值，以下公式同；A1为样品组的吸光度值，以下公式同；A2为样品本底(无水乙醇代替 DPPH溶液)的吸光度值。(2)ABTS 自由基清除率的测定：参考胡治远等13的方法。将 7mmol/LABTS 溶液以磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.4)稀释，在波长 734nm处测得吸光度值达到 0.7000.020。取 ABTS 溶液 3.0mL，加入不同质量浓度松茸粗多糖和各单糖组分溶液 0.4mL，混合后室温放置 30min，再测定波长 734nm 处的吸光度值，以 Vc 为阳性对照，按公式计算 ABTS 自由基的清除率：ABTS自由基清除率=1A1A2A0100%。式中：A2为样品本底(磷酸盐缓冲液代替 ABTS工作液)的吸光度值。(3)金属螯合能力的测定：参照文献 14 的方法。取不同质量浓度松茸粗多糖和各单糖组分溶液110云南农业大学学报第39卷3.5mL 至试管中，在室温下加入 2mmol/LFeCl20.1mL 和 5mmol/L 菲咯嗪 0.4mL，振动反应10min，测定 562nm 处的吸光度值，以 EDTA-2Na 为阳性对照，按公式计算金属螯合能力：金属螯合能力=1A1A2A0100%。式中：A2为样品本底(超纯水代替 FeCl2溶液)的吸光度值。(4)还原能力的测定：参考 FAN 等15方法。取不同质量浓度松茸粗多糖和各单糖组分溶液各1mL，加入 1%()铁氰化钾溶液 1mL、pH6.6磷酸盐缓冲液 1mL，混合均匀，混合物在 50恒温 20min 后，加入 10%()三氯乙酸溶液 2mL，然后在 3000r/min离心 10min，取上清液 2mL，加入蒸馏水 2mL、0.1%()三氯化铁 0.4mL，混合均匀，室温静置 10min，测定 700nm 处的吸光度值，以 Vc 为阳性对照，按公式计算松茸粗多糖的还原能力：还原能力=A1A2。式中：A2为样品本底(超纯水代替三氯化铁溶液)的吸光度值。根据松茸多糖在不同质量浓度下的清除率和吸光度值拟合得到回归方程，通过半数抑制浓度(medianinhibitionconcentration，IC50)比较松茸多糖不同组分的抗氧化活性。1.4数据处理与统计分析各试验做 3 组平行，试验数据采用 Origin8.0、SPSSStatistics18.0 和 Design-Expert.8.0.6 进行分析。2 结果与分析2.1葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线见图 1。回归方程为 y=0.009x0.001，R2=0.9992，其中，y 为葡萄糖的吸光度值，x 为葡萄糖质量浓度(g/mL)。2.2不同单因素对松茸粗多糖提取率的影响随着料液比、浸提时间、浸提温度的增加，松茸粗多糖提取率均呈先升高后降低的趋势(图 2)。液料比为 130(gmL)、浸提时间为 2h、浸提温度为 85 时，松茸粗多糖提取率分别最高，分别为 8.22%、8.13%和 8.65%，因此，以上条件为最优单因素处理。2.3响应面优化结果在单因素试验基础上设计响应面试验，结果(表 2)显示：松茸粗多糖提取率介于 5.130%8.824%之间。5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6500.10.20.30.40.50.6吸光度值absorbance value/(gmL1)y=0.009 0 x0.001 0R2=0.999 2图 1 葡萄糖标准曲线Fig.1Standardcurveofglucose1101201301401506.06.57.07.58.08.5提取率/%extraction rate料液比/(g mL)solid-liquid ratio123456.57.07.58.08.5浸提时间/hextraction time50607080901006789浸提温度/extraction temperature图 2 料液比、浸提时间和浸提温度对松茸粗多糖提取率的影响Fig.2Effectsofsolid-liquidratio,extractiontimeandextractiontemperatureontheextractionrateofTricholoma matsutakecrudepolysaccharide第2期梁双敏，等：松茸粗多糖的提取工艺优化、单糖组成及体外抗氧化活性1112.3.1回归模型分析松茸粗多糖提取率(Y)对浸提时间(A)、料液比(B)、浸提温度(C)的回归模型为：Y=8.59+0.54A+0.15B0.022C1.38A20.87B20.67C2+0.11AB0.85AC+0.38BC，校 正 系 数 R2=0.973 1，R2Adj=0.9385，变异系数为 3.3%；模型 P=0.00010.05(表 3)。影响提取率的因素依次为：浸提时间料液比浸提温度。2.3.2响应面优化分析松茸粗多糖提取率受浸提时间的影响大于料液比，料液比与浸提温度 2 个因素交互作用显著，提取率受浸提时间的影响大于浸提温度(图 3)。因此，提取率的最大影响因素是浸提时间，其次是料液比和浸提温度，与方差分析结果一致。2.3.3松茸粗多糖提取率的验证经回归模型分析，松茸粗多糖最佳提取工艺为：浸提时间 2.25h，料液比 130.67(gmL)，浸提温度 83.45；对该条件进行优化后的提取工艺为：浸提时间 2.25h，料液比 131(gmL)，浸提温度 83.50。3 次平行试验结果显示：松表 2 Box-Behnken 试验设计及响应值Tab.2DesignandresponsevalueofBox-Behnkenexperiment组号number试验因素experimentalfactor粗多糖提取率/%extractionrateofcrudepolysaccharide浸提时间/hextractiontime料液比/(gmL)solid-liquidratio浸提温度/extractiontemperature12.0014075.006.61822.0013085.008.64231.0013075.005.13041.0013095.006.75852.0013085.008.82462.0012075.007.52273.0014085.007.31281.0014085.006.11893.0013095.006.264102.0013085.008.302112.0013085.008.652121.0012085.005.602132.0013085.008.550143.0013075.008.030153.0012085.006.350162.0012095.006.746172.0014095.007.358表 3 方差分析与显著性判断Tab.3Analysisofvarianceandjudgmentofsignificance变异来源sourceofvariation平方和sumofsquare自由度degreeoffreedom样本方差samplevarianceF检验F-test显著水平significantlevel显著性significance模型model20.4792.2728.140.0001*浸提时间(A)extractiontime2.3612.3629.250.0010*料液比(B)solid-liquidratio0.1710.172.170.1737浸提温度(C)extractiontemperature0.0010.000.050.8348A28.0418.0499.530.0001*B23.1613.1639.130.0004*C21.8711.8723.150.0019*AB0.0510.050.620.4585AC2.8812.8835.640.0006*BC0.5710.577.110.0322*残差residual0.5770.08失拟项lackoffit0.4230.143.840.1133纯误差pureerror0.1540.04总误差totalerror21.0316注/Note:*.P0.01，*.0.01P松茸粗多糖TMP-2TMP-3TMP-1。由图 8 可知：当质量浓度为 0.254.00mg/mL时，松茸粗多糖、松茸多糖不同组分和 Vc 的ABTS 自由基清除率均随着质量浓度的增加而升高，质量浓度为 4.00mg/mL 时，松茸粗多糖、TMP-1、TMP-2、TMP-3 和 Vc 的 ABTS 自由基清除率分别为 89.98%、39.91%、85.56%、78.53%和 100.04%，IC50值依次为 0.507、14.514、0.525、0.716 和 0.001mg/mL，ABTS 的清除能力为 Vc松茸粗多糖TMP-2TMP-3TMP-1。由图 9 可知：当质量浓度为 4.00mg/mL 时，松茸粗多糖、TMP-1、TMP-2、TMP-3 和 EDTA-2Na 的金属螯合能力分别为 83.41%、36.22%、69.13%、48.18%和 99.93%，IC50值依次为 0.602、9.671、0.870、4.786 和 0mg/mL，其中，松茸粗多糖和 TMP-2 表现出较强的金属螯合能力，但都低于 EDTA-2Na。由图 10 可知：松茸多糖的还原能力随着质量浓度的升高而增强，当质量浓度为 4.00mg/mL时，松茸粗多糖、TMP-1、TMP-2、TMP-3 和 Vc的还原能力分别为 0.872、0.056、0.822、0.764和 1.477，IC50值依次为 1.348、110.142、1.517、1.840 和 0mg/mL，还原能力为：Vc松茸粗多糖TMP-2TMP-3TMP-1。3 讨论3.1松茸多糖单因素试验结果松茸药用价值极高且较为稀少，松茸多糖是目前研究热点之一，如何最大限度获得松茸多糖也成为亟待解决的问题。目前，松茸粗多糖的提取方法有微波提取法16、热水提取法17、超声波提取法18等，但存在方式单一、操作复杂的缺点。采用超声辅助水提醇沉法19，将 2 种提取方法进行复合提取，能够有效提高提取率、缩短提取时间。通过前期预试验，确定料液比、浸提时间、浸提温度对提取工艺的影响较大，因此选用这 3 个单因素进行提取工艺研究。杨惠舒等20采用响应面法优化石韦多糖提取工艺，确定最佳提取料液比为 127(gmL)，提取率为 3.96%，提取过程中料液比超过最佳料液比时，总多糖提取率有降低趋势，与本研究结果相近。分析其原因可能是原料中多糖含量有限，料液比不断增加，溶出率出现峰值，多糖溶出完全；但料液比持续5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6500.10.20.30.40.50.6y=0.009 1x+0.007 1R2=0.999 3吸光度值absorbance value/(gmL1)图 4 蛋白质标准曲线Fig.4Standardcurveofprotein05010015020025030035000.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0TMP-1TMP-2TMP-3TMP-4吸光度值absorbance value管数tubes number 00.20.40.60.8cNaCl/(molL1)图 5 松茸粗多糖经 DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱分级分离的图谱Fig.5StepwiseelutioncurveofT.matsutakecrudepolysaccharideonDEAE-SepharoseFastFlowioncolumn114云南农业大学学报第39卷增加，原料与溶液的分离操作难度增加，使部分多糖损失，提取率反而降低。王兰英等21提取发酵虫草多糖 1.5h 时，多糖提取含量达到最高，超过 1.5h 后多糖提取含量开始下降，与本研究多糖浸提时间的上升趋势相近。随着浸提时间增加，多糖提取率先增加后下降，可能是部分小分子多糖开始降解，从而降低多糖提取率。王君等22采用超声辅助提取金丝皇菊多糖，提取率随着温度的升高呈先升后降的趋势，并在 70 时达到峰值(84.813mg/g)，这是因为温度不断升高，分子之间运动加快，多糖溶解度不断提高，从而提高了多糖提取率；当温度达到 85 时，多糖已基本溶出，温度持续升高，多糖结构被破坏，多糖提取率降低。因此，本研究最佳料液比为 130(gmL)，浸提时间为 2h，浸提温度为85。3.2松茸多糖提取条件的优化基于 Box-Behnken 设计的响应面方法优化松茸多糖的提取，得到最佳工艺条件为：浸提时间2.25h，料液比131(gmL)，浸提温度83.50，在此条件下多糖提取率为 8.67%。YIN 等5采用响应面法优化了逆流探针超声提取松茸多糖的工01020304050607080020406080100a)b)c)d)响应值response value01020304050607080时间/mintime01020304050607080FucGalNGalGlcNManGlcARhaAraGlcGlcNAcXylFruRibGalAGulAManA0255075100125150175200FucGlcNGalGlcManRha0255075100125150175FucGlcNGalGlcManGlcA01020304050607080020406080100FucGlcNGalGlcManGlcA图 6 16 种标准单糖(a)和松茸多糖纯化组分 TMP-1(b)、TMP-2(c)、TMP-3(d)的离子色谱图Fig.6Ionchromatogramsof16standardmonosaccharides(a)andpurifiedcomponentsofTMP-1(b),TMP-2(c)andTMP-3(d)fromT.matsutakepolysaccharide表 4 松茸多糖纯化组分的单糖含量Tab.4ContentofpurifiedcomponentsofpolysaccharidesfromT.matsutake%组分component岩藻糖fucose鼠李糖rhamnose盐酸氨基葡萄糖glucosaminehydrochloride半乳糖galactose葡萄糖glucose甘露糖mannose葡萄糖醛酸glucuronicacidTMP-12.12.90.47.175.412.2未检出notdetectedTMP-28.9未检出notdetected0.919.643.522.64.5TMP-36.6未检出notdetected8.614.652.012.06.1第2期梁双敏，等：松茸粗多糖的提取工艺优化、单糖组成及体外抗氧化活性115艺，其最大产率为 8.11%；陈炼红等6采用复合酶法从松茸中提取多糖，提取率为 6.95%；吴杨洋等7研究发现：热水浸提和超声提取的松茸多糖提取率较高，分别为 9.34%和 8.06%。本研究采用超声波辅助水提醇沉法提取松茸粗多糖，与其他方法相比能够显著提高多糖提取率。此外，松茸多糖提取率存在差异，可能与原料生长环境、产地、生长状态等外部条件有关，在提取多糖时应将这些条件考虑在内。从模型的方差分析、响应面和等高线图可以看出：料液比与浸提温度的交互作用项极其显著，料液比与浸提温度的交互作用项显著，其余项均为不显著。对松茸粗多糖的提取率影响最大的因素是浸提时间，其次是料液比和浸提温度。3.3松茸多糖的分离纯化与单糖组成本研究松茸多糖分离纯化出 4 种新多糖组分：TMP-1、TMP-2、TMP-3 和TMP-4，其中TM-P-4 含量较低。YAN 等23从杏鲍菇、金针菇、平菇和白褐菇中获得了 4 种水溶性多糖富集组分，经分离纯化得到 1 种中性多糖和 1 种酸性多糖；LIU 等24将牡蛎王菇粗多糖在 DEAE-纤维素柱洗0.250.50 1.002.003.004.000102030405060708090100DPPH 自由基清除率/%/(mgmL1)Crude TMPTMP-1TMP-2TMP-3VcDPPH radical scavenging rate注：CrudeTMP.松茸粗多糖；下同。注：CrudeTMP.T.matsutakecrudepolysaccharide;thesameasbelow.图 7 松茸多糖不同组分的 DPPH 自由基清除率Fig.7DPPHradicalscavengingrateofdifferentcomponentsfromT.matsutakepolysaccharide0.25 0.50 1.002.003.004.000102030405060708090100ABTS 自由基清除率/%Crude TMPTMP-1TMP-2TMP-3Vc/(mgmL1)ABTS radical scavenging rate图 8 松茸多糖不同组分的 ABTS 自由基清除率Fig.8ABTSradicalscavengingrateofdifferentcomponentsfromT.matsutakepolysaccharide0.25 0.50020406080100Fe2+螯合力/%Fe2+chelating ability/(mgmL1)Crude TMPTMP-1TMP-2TMP-3EDTA-2Na1.002.003.004.00图 9 松茸多糖不同组分的金属离子螯合力Fig.9MetalironchelatingabilityofdifferentcomponentsfromT.matsutakepolysaccharide00.20.40.60.81.01.21.41.6还原能力reducing abilityCrude TMPTMP-1TMP-2TMP-3Vc0.25 0.50/(mgmL1)1.002.003.004.00图 10 松茸多糖不同组分的还原能力Fig.10ReducingabilityofdifferentcomponentsfromT.matsutakepolysaccharide116云南农业大学学报第39卷脱，得到 3 种组分。本研究显示：TMP-1 单糖组成为岩藻糖、盐酸氨基葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖；TMP-2 和 TMP-3 单糖组成种类一致，包括岩藻糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，但含量有差别。食用菌中含有葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、木糖等多种杂多糖，TMP-1、TMP-2 和TMP-3 的单糖组成在灵芝和金针菇中也有发现25。3.4不同组分松茸多糖的体外抗氧化活性本研究表明：松茸粗多糖、TMP-1、TMP-2和 TMP-3 具有较强的 DPPH 和 ABTS 自由基清除能力、金属螯合能力以及还原能力，松茸多糖具有较好的抗氧化能力，其中松茸粗多糖的抗氧化活性最好，可能与粗多糖中其他抗氧化剂含量有关；TMP-2 和 TMP-3 抗氧化活性均优于 TMP-1，可能与单糖组成有关。研究表明：多糖组成与抗氧化活性密切相关26。YUAN 等27测定了桑叶多糖(MLP)中 粗 MLP、MLP-3a 和 MLP-3b 对DPPH 自由基的清除率分别为 68.21%、40.44%和60.17%，与本研究结果相似；粗 MLP 的 DPPH自由基清除率高于分离纯化后的多糖组分，可能是粗多糖中含有多酚，而 MLP-3b 的抗氧化活性比 MLP-3a 更高，这可能是由于 MLP-3b 的糖醛酸含量较高。本研究中，TMP-2 和 TMP-3 清除DPPH 自由基的能力高于 TMP-1，这可能与 2 种组分都含有糖醛酸有关。CHEN 等28研究表明：茯砖茶中多糖对 ABTS 自由基清除活性与半乳糖含量有关，而本研究的 TMP-1、TMP-2 和 TMP-3中半乳糖是其主要单糖成分，其半乳糖含量存在一定差异可能是发挥清除 ABTS 自由基作用的原因之一。JIANG 等29研究了青蛤多糖(CSPS)的抗氧化活性，CSPS-3 比 CSPS-1 或 CSPS-2 具有更好的 Fe2+螯合作用。据报道，具有金属离子螯合活性的化合物通常包含OH、SH、COOH、C=O、S和O中 2 个或 2 个以上的官能团30。CSPS-3 的螯合作用可能是由于结构中的强Fe2+螯合基团。本研究中，松茸粗多糖、TMP-2 比TMP-1、TMP-3 的金属离子螯合活性高，可能是由于 TMP-2 的结构中含有强 Fe2+螯合基团。LIU等31对竹荪多糖(DIP)抗氧化性的研究结果与本研究结果相似，DIP 的还原能力虽然没有预期高，但具有浓度依赖性，TMP 的还原能力也有一定的浓度依赖性。本研究表明：TMP-1、TMP-2和 TMP-3 为酸性杂多糖，这与 TONG 等18的研究结果相似，其研究从松茸子实体中分离出 2 种具有显著抗氧化活性的多糖成分 TM-APS-1 和TM-APS-2，2 种多糖均由葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，且葡萄糖含量较高，有利于氢键形成，可以增强多糖清除自由基的能力，从而提高抗氧化活性。但是，对于松茸多糖的抗氧化机制还需要进一步研究。4 结论本研究通过超声波辅助水提醇沉法提取松茸粗多糖，确定最佳提取工艺为：浸提时间 2.25h，料液比 131(gmL)，浸提温度 83.50，此条件下多糖提取率为 8.42%。松茸粗多糖分离纯化得到 3 种多糖组分：TMP-1、TMP-2 和 TMP-3，其组成主要为：葡萄糖、甘露糖和半乳糖，但含量有差别。松茸多糖表现出一定的抗氧化能力，对 DPPH 和 ABTS 自由基都有较好的清除效果，同时具有较好的金属离子螯合能力和还原能力。其中，松茸粗多糖的抗氧化活性最好，其次为TMP-2、TMP-3 和 TMP-1。该研究为松茸粗多糖的分离纯化、结构解析、生物活性研究以及开发具有潜力的功能性食品提供了理论依据。参考文献李万辉,杨什补,苟梅花,等.松茸多糖的研究进展J.农业技术与装备,2020,369(9):109.DOI:10.3969/j.issn.1673-887X.2020.09.052.1周选围.松茸资源研究概况J.食用菌学报,2002,9(1):50.DOI:10.3969/j.issn.1005-9873.2002.01.012.2GUERIN-LAGUETTE A,VAARIO L M,MATSUS-HITAN,etal.Growthstimulationofa